FBW7對高糖誘導(dǎo)腎系膜細胞自噬信號的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：20％～40%糖尿病患者可能會發(fā)生糖尿病腎病,最后發(fā)展為腎功能衰竭尿毒癥。強化血糖控制可以延緩糖尿病腎病的發(fā)生，但高血糖狀態(tài)下引起腎臟病變的機制尚未明確。目前研究表明自噬參與了糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展，自噬可以降解衰老的細胞器、多余的蛋白、有害的細胞質(zhì)成分,有研究表明糖尿病腎病的小鼠比正常小鼠自噬水平低。調(diào)節(jié)自噬信號最經(jīng)典的負(fù)調(diào)控信號途徑是P13K-Akt-mTOR，mTOR可作為FBW7的底物蛋白，能被泛素化修飾并被蛋白酶體降解，F(xiàn)B

2、W7是SCF型(Skp1–Cullin1–F-box protein) E3泛素連接酶的識別亞基。糖尿病mTOR信號分子究竟如何表達，F(xiàn)BW7是否參與了對mTOR信號通路的調(diào)節(jié)進而參與了糖尿病腎病的發(fā)生？為此，我們體外培養(yǎng)腎系膜細胞，研究高糖對FBW7表達的影響及其對自噬信號的調(diào)控作用，為深入研究糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）不同濃度葡萄糖對腎系膜細胞FBW7、LC3-II/I、mTOR、p-mTOR、

3、I型膠原蛋白（Col-I）、IL-1β、caspase-1表達以及自噬溶酶體的影響:將小鼠腎系膜細胞進行體外培養(yǎng)72h，分組如下①正常糖組(NC)；②滲透壓對照組（OP）；③高糖干預(yù)組(10mmol/L葡萄糖，HG1組)；④高糖干預(yù)組(20mmol/L葡萄糖，HG2組)；⑤高糖干預(yù)組(30mmol/L葡萄糖，HG3組)。采用western blot檢測FBW7、mTOR、p-mTOR的表達水平以及LC3-II/I比值，采用RT-PCR進

4、一步檢測FBW7的mRNA水平；采用激光共聚焦顯微鏡檢測自噬溶酶體；采用ELISA檢測Col-I、IL-1β、caspase-1表達。
　　（2）不同時間高糖對腎系膜細胞LC3-II/I、FBW7、mTOR、p-mTOR、自噬溶酶體、Col-I、IL-1β、caspase-1表達的影響：以5．6 mmol/L葡萄糖為對照，用30mmol/L高糖分別對小鼠腎小球系膜細胞細胞干預(yù)2h、6h、12h、24h、48h、72h，并采用上述技

5、術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　?。?）雷帕霉素干預(yù)對腎系膜細胞mTOR、p-mTOR、LC3-II/I、Col-I、IL-1β、caspase-1、自噬溶酶體的影響：將小鼠腎小球系膜細胞體外培養(yǎng)72h，使用雷帕霉素抑制mTOR。分組如下①NC組；②NC-RAPA3組；③HG3組；④HG3-RAPA3組。采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　?。?）基因沉默F(xiàn)BW7對系膜細胞mTOR、p-mTOR、LC3-II/I、

6、自噬溶酶體、Col-I、IL-1β、caspase-1表達的影響：選擇自噬最強的條件進行基因沉默F(xiàn)BW7，分組如下①NC組;②NC-si FBW7組；③HG3組；④HG3-si FBW7組。采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　?。?）過表達 FBW7對系膜細胞FBW7、LC3-II/I、mTOR、p-mTOR、自噬溶酶體、Col-I、IL-1β、caspase-1表達的影響：選擇自噬最弱的條件進行過表達 FBW7實驗，分組

7、如下①NC-LV-CON238組；②NC-LV- FBW7組；③HG3-LV-CON238組；④HG3-LV-FBW7組。采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　　結(jié)果：
　?、僖圆煌瑵舛鹊钠咸烟浅掷m(xù)刺激小鼠腎小球系膜細胞72小時，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高，F(xiàn)BW7、LC3-II/I比值和自噬溶酶體表達水平越低，mTOR、p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1的表達水平越高(P<0．05)。
　?、?0

8、mmol/L高糖分別對小鼠腎系膜細胞刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h，發(fā)現(xiàn)12h組FBW7、LC3-II/I比值和自噬溶酶體顯著增加，mTOR和p-mTOR蛋白表達顯著減少(P<0．05)。72h組FBW7、LC3-II/I比值和自噬溶酶體表達顯著減少，mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達顯著增加(P<0．05)。自噬活性最強的刺激條件30mmol/L葡萄糖刺激12小時，自噬活性最弱的條件

9、是30mmol/L葡萄糖刺激72小時。③雷帕霉素干預(yù)高糖刺激的腎系膜細胞，mTOR、p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達顯著減少，LC3-II/I比值顯著增加，自噬溶酶體數(shù)目顯著增加(P<0．05)。④基因沉默F(xiàn)BW7可使FBW7、LC3-II/I比值顯著減少，mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達顯著增加，自噬溶酶體數(shù)目顯著減少(P<0．05)。⑤過表達FBW7實驗可使FBW7、

10、LC3-II/I比值顯著增加，mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達顯著減少，自噬溶酶體數(shù)目顯著增加(P<0．05)。
　　結(jié)論：
　　1.短時間的高糖刺激可以上調(diào)FBW7表達，抑制mTOR，引起小鼠腎系膜細胞自噬活性增強，可能對早期糖尿病腎臟有保護作用。
　　2.長時間高糖刺激可以下調(diào)FBW7表達激活mTOR，引起小鼠腎系膜細胞自噬水平的降低，可能參與腎臟炎癥和纖維化的形成。