SUMO化修飾酶PIASy對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞NF-κB信號的調(diào)控研究.pdf

1、目的:糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病一種嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制不清，糖代謝和腎臟血流動力學(xué)異常所致的病理生理改變是糖尿病腎病發(fā)生的基礎(chǔ)。在糖尿病腎病早期腎組織中可見單核巨噬細(xì)胞浸潤，核因子-κ B(neclear factor-κB，NF-κB)等大量炎癥因子產(chǎn)生增加，提示炎癥反應(yīng)是DN發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而NF-κB作為炎癥調(diào)節(jié)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子又受多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)節(jié)，如磷酸化、泛素化、小

2、泛素化修飾物(smallubiquitin-related modifier protein，SUMO)修飾。SUMO化修飾是通過蛋白-蛋白相互作用而賦予靶蛋白新的生物特性。它通過加強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定、DNA修復(fù)、核質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而調(diào)控靶蛋白。蛋白質(zhì)的SUMO化修飾通過E1活化酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶作用完成對靶細(xì)胞的修飾。其中E3連接酶是底物識別的關(guān)鍵酶，而PIAS家族是一類E3連接酶，它可加強(qiáng)底物的SUMO化修飾或是作為

3、構(gòu)架蛋白來調(diào)控關(guān)鍵信號分子的轉(zhuǎn)錄活性。有研究發(fā)現(xiàn)PIASy可誘導(dǎo)IκB激酶γ(IκBkinase，IKKγ)發(fā)生SUMO化，從而激活NF-κB信號通路。但目前在糖尿病腎病中，SUMO化修飾酶PIASy是否參加NF-κB信號調(diào)控研究尚少。因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同時間和濃度的高糖刺激大鼠腎系膜細(xì)胞后，觀察SUMO化修飾酶PIASy、NF-κB信號激活關(guān)鍵信號分子(IκBα、p-Iκ Bα、p-NF-κ Bp65、IKKγ)和下游炎癥因子白細(xì)胞

4、介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein1，MCP-1)的表達(dá)，再通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIASy-siRNA干擾PIASy后再次觀察NF-κB信號關(guān)鍵因子的改變，同時觀察PIASy和IKKγ的細(xì)胞定位，旨在探討SUMO化修飾酶PIASy對高糖介導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞的NF-κB信號通路的調(diào)控作用和可能機(jī)制，為糖尿病腎病的防治提供新的特異性靶點(diǎn)。
　　方法:

5、(1)細(xì)胞的培養(yǎng)與分組:體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，以高糖作為刺激因子，分為以下三組:①正常對照組（NC組）:培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖;②高糖干預(yù)組（HG組）:按照培養(yǎng)基葡萄糖濃度梯度分3個組，HG1組:培養(yǎng)基含10mmol/L葡萄糖;HG2組:培養(yǎng)基含20mmol/L葡萄糖;HG3組:培養(yǎng)基含30mmol/L葡萄糖;③滲透壓對照組(OP組):培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇。(2)各組細(xì)胞培養(yǎng)6h、

6、12h、24h、48h、72h后，用Western-blot檢測PIASy、IκBα、p-Iκ Bα、p-NF-κ B的蛋白表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)上清液IL-6、MCP-1濃度。(3)PIASy的RNA干擾研究:篩選出最佳高糖作用濃度和時間后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIASy-siRNA，再次進(jìn)行分組::①siNC組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染control-siRNA加入含5.6 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng);②siPIASy組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIASy-siRNA加入

7、含5.6mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng);③HG+siNC:細(xì)胞轉(zhuǎn)染control-siRNA加入含30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基作用24h;④HG+siPIASy組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIASy-siRNA加入含30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基作用24h。(4)采用免疫熒光染色檢測PIASy和IKKγ在細(xì)胞中的表達(dá)及定位。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x)±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分

8、析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.與NC相比，高糖可以刺激PIASy蛋白和mRNA表達(dá)（P＜0.05），且呈一定時間濃度依賴性。2.與NC相比，高糖可以降低IκBα、增加p-IκBα和p-NF-κ B蛋白表達(dá)(P＜0.05)，且具有一定時間濃度依賴性。3.不同時間和濃度的高糖刺激未改變IKKγ的mRNA和蛋白表達(dá)(P＞0.05)，高糖誘導(dǎo)PIASy和IKKγ在細(xì)胞同一位置的黃色熒光表達(dá)

9、增強(qiáng)。4.高糖可增加系膜細(xì)胞上清液IL-6、MCP-1的水平，并呈時間濃度依賴性增強(qiáng)（P＜0.05）。5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIASy-siRNA后成功抑制PIASy表達(dá)（P＜0.05）。與siNC組相比，siPIASy組顯示IκBα表達(dá)顯著增強(qiáng)、p-Iκ Bα和p-NF-κB則顯著減弱（P均＜0.05）。6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIASy-siRNA后，與siNC組比較顯示IL-6、MCP-1濃度顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:1.高糖可使腎系膜細(xì)胞PIASy