大鼠Gsk3β基因過表達(dá)及Gsk3β抑制劑SB-216763對(duì)肝卵圓細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　 1.研究Gsk3β基因過表達(dá)通過Wnt信號(hào)通路對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖的影響及其調(diào)控機(jī)制;
　　 2.研究Gsk3β抑制劑SB-216763通過Wnt信號(hào)通路對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建并鑒定大鼠Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體PGC-FU-Gsk3β-EGFP，檢測該慢病毒的轉(zhuǎn)染效率，并篩選其處理肝卵圓細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI);
　　 2.配

2、制不同濃度的Gsk3β抑制劑SB-216763，并篩選抑制劑SB-216763處理肝卵圓細(xì)胞的濃度梯度;
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組:將大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F344分為空白慢病毒載體對(duì)照組、Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體組，以及DMSO對(duì)照組和Gsk3β抑制劑組，其中抑制劑組SB-216763設(shè)立4個(gè)濃度梯度，即0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L;
　　 4.將大鼠Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體和空白慢病毒載體與大鼠肝

3、卵圓細(xì)胞系WB-F344共培養(yǎng)，在相差倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下分別觀察兩組細(xì)胞形態(tài)及其生長狀態(tài)，以及慢病毒感染后細(xì)胞的熒光表達(dá)情況;
　　 5.將各個(gè)濃度梯度的Gsk3β抑制劑SB-216763(即濃度分別為O、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L)與大鼠肝卵圓細(xì)胞系WB-F344共培養(yǎng)，在相差倒置顯微鏡下觀察各個(gè)抑制劑組細(xì)胞形態(tài)及其生長狀態(tài);
　　 6.采用細(xì)胞活性計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8試劑盒）檢測Gsk3β基

4、因過表達(dá)慢病毒載體和空白慢病毒載體及各個(gè)濃度梯度的Gsk3β抑制劑SB-216763對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞系WB-F344增殖的影響，Annexin V-FITC/PI流式凋亡試劑盒檢測Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體組和空白慢病毒載體對(duì)照組中肝卵圓細(xì)胞的凋亡情況，Western blot免疫蛋白印跡技術(shù)檢測各組細(xì)胞Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Gsk3β、β-catenin及cyclin D1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.成

5、功構(gòu)建并正確鑒定出大鼠Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體PGC-FU-Gsk3β-EGFP，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)該慢病毒載體可高效穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染大鼠肝卵圓細(xì)胞系WB-F344，而且發(fā)現(xiàn)它的最佳感染復(fù)數(shù)為MOI=25。
　　 2.肝卵圓細(xì)胞經(jīng)Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體和空白慢病毒載體處理后，可以發(fā)現(xiàn)Gsk3β基因過表達(dá)慢病毒載體組細(xì)胞數(shù)目較少，狀態(tài)不佳，老化明顯，且可見大量綠色熒光出現(xiàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Gsk3β基因過表達(dá)慢病

6、毒載體組細(xì)胞增殖減慢(t=7.178，P＜0.01)，凋亡顯著。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)組細(xì)胞的Gsk3β蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，β-catenin及cyclin D1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度減弱。
　　 3.肝卵圓細(xì)胞經(jīng)抑制劑SB-216763處理后，可以發(fā)現(xiàn)各Gsk3β抑制劑組細(xì)胞分裂增殖旺盛，狀態(tài)良好，幾乎未見明顯死亡細(xì)胞，而且各組的細(xì)胞數(shù)目隨著抑制劑SB-216763濃度的升高而增多，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各Gsk3