高糖微環(huán)境通過GSK3β調(diào)控Cyclin D1、CXCR-4影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖遷移.pdf

1、糖尿病患者接受口腔種植術(shù)后比正常缺失牙患者的高失敗率越來越被受到口腔種植方面研究的重視。糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，血糖高是糖尿病的主要癥狀。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病可以造成骨代謝異常，成骨質(zhì)量不佳[1]。而成骨質(zhì)量與口腔種植的成功與否有著密切的聯(lián)系。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在骨代謝方面發(fā)揮著巨大的作用。已有研究證實(shí)在高糖環(huán)境下BMSCs的生理功能受到影響從而影響到成骨的質(zhì)量。
　　糖原合成激酶3β(GSK3β)是生物

2、學(xué)功能多樣的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSK3β是糖代謝的重要調(diào)控蛋白，在葡萄糖水平的調(diào)節(jié)以及糖尿病相關(guān)指標(biāo)的改變上發(fā)揮著重要的作用。GSK3β可以調(diào)控β-Catenin的磷酸化及穩(wěn)定，而Cyclin D1是β-catenin/LEF-1通路下游的靶基因，同時(shí)也是一個(gè)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的因子。而也有研究證實(shí)抑制GSK3β可以通過上調(diào)CXCR-4的表達(dá)來促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力。因此GSK3β是一個(gè)與Cyclin D1以及CXCR-4關(guān)系

3、密切的因子。
　　干細(xì)胞微環(huán)境是指影響干細(xì)胞增殖分化等生理功能的一切因素。本實(shí)驗(yàn)采用高糖微環(huán)境誘導(dǎo)大鼠來源的BMSCs，觀察高糖微環(huán)境條件下的BMSCs細(xì)胞增殖及定向遷移能力，同時(shí)結(jié)合GSK3β、Cyclin D1以及CXCR-4進(jìn)一步探討高糖微環(huán)境調(diào)控BMSCs增殖以及定向遷移能力的機(jī)理。為糖尿病影響口腔種植成功率提供基礎(chǔ)依據(jù)。
　　第一部分大鼠BMSCs的提取、鑒定及生物學(xué)功能檢測(cè)
　　目的:從SD大鼠提取BMSC

4、s并對(duì)其表面分子標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，檢測(cè)其增殖、克隆形成能力以及成脂成骨分化能力。
　　方法:從3周齡SD大鼠提取BMSCs，體外傳代培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞儀對(duì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)其增殖能力，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成脂成骨誘導(dǎo)及染色，檢測(cè)細(xì)胞的多項(xiàng)分化能力。
　　結(jié)果:提取的BMSCs呈紡錘形，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物:CD90、CD105陽性，CD34、CD45呈陰

5、性，生長(zhǎng)第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第6天進(jìn)入平臺(tái)期，具有克隆形成能力和成骨及成脂的多項(xiàng)分化潛能。
　　結(jié)論:成功提取出SD大鼠的BMSCs，細(xì)胞符合干細(xì)胞的表面CD袁型，具有增殖的潛能以及克隆形成的能力，具有多項(xiàng)分化潛能。
　　第二部分高糖微環(huán)境通過抑制Cyclin D1影響B(tài)MSCs的增殖
　　目的:結(jié)合Cyclin D1探討高糖微環(huán)境對(duì)于BMSCs增殖的影響
　　方法:采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同糖濃度下(5.

6、5rmM，16.5mM) BMSCs的增殖能力，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)高糖微環(huán)境對(duì)BMSCs細(xì)胞周期的影響。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)高糖微環(huán)境對(duì)Cyclin D1表達(dá)的影響。Western Blots檢測(cè)高糖微環(huán)境對(duì)Cyclin D1及CDK4表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)結(jié)果顯示高糖微環(huán)境可以抑制BMSCs的增殖，同時(shí)細(xì)胞周期結(jié)果顯示高糖微環(huán)境可以抑制細(xì)胞從G1期向S期過度。RT-PCR及Western blots結(jié)

7、果顯示高糖微環(huán)境可以抑制細(xì)胞CyclinD1及CDK4的表達(dá)。
　　結(jié)論:高糖微環(huán)境可以通過抑制BMSCs中CyclinD1的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖能力。
　　第三部分高糖微環(huán)境通過抑制CXCR-4影響B(tài)MSCs的定向遷移
　　目的:結(jié)合CXCR-4探討高糖微環(huán)境對(duì)于BMSCs定向遷移能力的影響。
　　方法:采用Transwell技術(shù)檢測(cè)不同糖濃度下(5.5mM，16.5mM) SDF-1以及CXCR-4抑制劑AMD

8、3100對(duì)BMSCs定向遷移能力的影響。利用RT-PCR以及Western Blots檢測(cè)高糖微環(huán)境對(duì)細(xì)胞CXCR-4表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:在不同糖濃度下SDF-1均可以促進(jìn)BMSCs的定向遷移，AMD3100可以抑制SDF-1的促進(jìn)作用。高糖微環(huán)境可以抑制BMSCs在SDF-1條件下的定向遷移能力。RT-PCR及Western blots結(jié)果顯示高糖微環(huán)境可以抑制CXCR-4的表達(dá)。
　　結(jié)論:高糖微環(huán)境可以通過抑制CX

9、CR-4的表達(dá)影響SDF-1/CXCR-4生物軸調(diào)控BMSCs的定向遷移能力。
　　第四部分高糖微環(huán)境通過GSK3β調(diào)控BMSCs的增殖及定向遷移
　　目的:結(jié)合GSK3β、CyclinD1、CXCR-4探討高糖微環(huán)境對(duì)于BMSCs增殖以及定向遷移能力的影響。
　　方法:利用Western Blots檢測(cè)高糖微環(huán)境以及LiCl對(duì)不同糖濃度下GSK3β、β-Catenin表達(dá)的影響。利用RT-PCR檢測(cè)高糖微環(huán)境以及Li

10、Cl對(duì)不同糖濃度下LEF-1、Cyclin D1、CXCR-4表達(dá)的影響。利用MTT檢測(cè)LiCl對(duì)不同糖濃度下BMSCs增殖能力的影響，利用細(xì)胞周期檢測(cè)LiCl對(duì)不同糖濃度下BMSCs細(xì)胞周期的影響，利用Transwell檢測(cè)LiCl對(duì)不同糖濃度下BMSCs在SDF-1誘導(dǎo)狀態(tài)下的定向遷移能力的影響。
　　結(jié)果:高糖微環(huán)境可以促進(jìn)GSK3β的表達(dá)抑制β-Catenin、LEF-1及下游因子Cyclin D1的表達(dá)，抑制GSK3β可

11、以促進(jìn)β-Catenin、LEF-1及Cyclin D1的表達(dá)。高糖微環(huán)境可以抑制CXCR-4的表達(dá)，抑制GSK3β后可以促進(jìn)CXCR-4的表達(dá)。高糖微環(huán)境可以抑制BMSCs的增殖及定向遷移的能力，抑制GSK3β可以促進(jìn)BMSCs的增殖及定向遷移能力。對(duì)于細(xì)胞周期高糖微環(huán)境可以抑制細(xì)胞從G1期向S期過渡，而抑制GSK3β可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過渡。
　　結(jié)論:高糖微環(huán)境可以通過激活GSK3β抑制CyclinD1、CXCR-4的