人參總皂苷聯(lián)合大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高糖損傷 INS-1細(xì)胞的作用.pdf

1、 目的：通過(guò)連續(xù)性高糖刺激大鼠胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞,造成細(xì)胞活力及細(xì)胞功能的損傷后,撤去高糖環(huán)境。在不同藥物濃度人參總皂苷(TSPG)干預(yù)下,通過(guò)Transwell共培養(yǎng)小室,與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)間接共培養(yǎng),觀察各組 INS-1 細(xì)胞細(xì)胞功能相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物 A 基因(MafA)、胰腺十二指腸同源盒-1(PDX-1)的表達(dá)變化,基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌情況,及共培養(yǎng)階

2、段細(xì)胞外液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的含量,以確定INS-1細(xì)胞與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞間接共培養(yǎng)或者在人參總皂苷干預(yù)下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與INS-1細(xì)胞間接共培養(yǎng)能否修復(fù)高糖損傷的INS-1細(xì)胞及可能機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs),給予INS-1細(xì)胞連續(xù)性高糖刺激72小時(shí)后,停止高糖刺激,并通過(guò)Transwell共培養(yǎng)小室與BM-MSCs進(jìn)行間接共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為6組：1

3、.正常對(duì)照組：未經(jīng)高糖刺激的正常INS-1細(xì)胞；2.INS-1 細(xì)胞損傷模型對(duì)照組：經(jīng)連續(xù)性高糖刺激的 INS-1 細(xì)胞；3. 無(wú)TSPG共培養(yǎng)組：高糖刺激后的INS-1細(xì)胞+BM-MSCs共培養(yǎng)組；4. 50mg/L TSPG共培養(yǎng)組： 50mg/L TSPG +高糖刺激后的INS-1細(xì)胞+BM-MSCs；5. 100mg/L TSPG共培養(yǎng)組：100mg/L TSPG+高糖刺激后的INS-1細(xì)胞+BM-MSCs ；6. 200mg/

4、L TSPG共培養(yǎng)組：200mg/L TSPG+高糖刺激后的INS-1細(xì)胞+BM-MSCs。培養(yǎng)96小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后,分別提取各組INS-1細(xì)胞總RNA和蛋白,RT-PCR檢測(cè)MafA、PDX-1mRNA的表達(dá)水平；WB檢測(cè) PDX-1的蛋白表達(dá)變化；ELISA檢測(cè)各組INS-1細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌、葡萄糖刺激的胰島素分泌及共培養(yǎng)階段細(xì)胞外液中TGF-β含量。結(jié)果：(1)INS-1細(xì)胞高糖損傷模型的建立：與5.6mmol/l葡萄糖濃度的對(duì)

5、照組相比,20、30、40mmol/l濃度的葡萄糖處理后,各組細(xì)胞的OD值均有下降。參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究,選取在刺激時(shí)間為72h,對(duì)INS-1細(xì)胞功能亦有明顯損傷作用的30mmol/L的葡萄糖濃度作為建模濃度。(2)TSPG對(duì)INS-1細(xì)胞的毒性作用：400及800mg/L TSPG干預(yù)后,細(xì)胞OD值明顯下降,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),提示這一濃度范圍的TSPG能抑制INS-1細(xì)胞的活力與增殖。故本實(shí)驗(yàn)選取50、

6、100及200mg/L的TSPG濃度為干預(yù)濃度。(3)各組INS-1細(xì)胞MafA、PDX-1 mRNA的表達(dá)情況：與正常對(duì)照組比較,高糖損傷模型組INS-1細(xì)胞MafA及PDX-1 mRNA表達(dá)量均有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。與損傷對(duì)照組相比,200mg/L TSPG干預(yù)的共培養(yǎng)組 INS-1細(xì)胞MafA mRNA表達(dá)增強(qiáng)；100mg/L及200mg/L TSPG干預(yù)共培養(yǎng)組PDX-1 mRNA表達(dá)增加。(4)各組INS-

7、1細(xì)胞PDX-1蛋白的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比,高糖損傷模型組的各組 INS-1 細(xì)胞PDX-1 蛋白的表達(dá)均有下降。與損傷模型對(duì)照組比較,共培養(yǎng)組 PDX-1 蛋白表達(dá)增加。與無(wú) TSPG 干預(yù)的共培養(yǎng)組比較,200mg/L TSPG 干預(yù)組PDX-1蛋白表達(dá)增加。(5)各組細(xì)胞共培養(yǎng)階段細(xì)胞外液中TGF-β的含量：與正常對(duì)照組相比,高糖損傷對(duì)照組細(xì)胞外液中 TGF-β含量無(wú)明顯變化。與損傷模型對(duì)照組比較,共培養(yǎng)組細(xì)胞外液中 TGF-β

8、含量明顯增加。(6)各組INS-1細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌及葡萄糖刺激的胰島素分泌情況：與正常對(duì)照組相比,高糖損傷模型組INS-1細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素和葡萄糖刺激的胰島素分泌量均減少。與損傷對(duì)照組比較,共培養(yǎng)各組INS-1細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素和葡萄糖刺激的胰島素分泌量增加。與無(wú)TSPG共培養(yǎng)組比較,不同濃度的TSPG干預(yù)共培養(yǎng)組基礎(chǔ)胰島素的分泌量無(wú)明顯差異,而100和200 mg/L TSPG干預(yù)共培養(yǎng)組葡萄糖刺激的胰島素分泌量增加。結(jié)論：(1)BM-M