TIRC7在急性移植物抗宿主病中的作用研究.pdf

1、目的：探討TIRC7與急性GVHD的相關(guān)性及TIRC7分子在急性GVHD發(fā)生發(fā)展中的作用和可能的機(jī)制。
　　方法：⑴分別獲取急性GVHD患者治療前后的外周血血漿及單個(gè)核細(xì)胞等樣本，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)等方法，檢測TIRC7及CTLA-4在急性GVHD患者治療前后的指標(biāo)變化，明確TIRC7及CTLA-4與急性GVHD的相關(guān)性。⑵應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及蛋白印跡(Western blot)等

2、檢測手段，選擇急性GVHD患者淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用質(zhì)粒構(gòu)建及電穿孔等方法，觀察TIRC7對CTLA-4的調(diào)控、T細(xì)胞活化及其對細(xì)胞因子分泌等的影響。⑶以SPF級C57BL/6鼠為供鼠，BALB/c鼠為受鼠，參照本實(shí)驗(yàn)室成熟的建模方案建立小鼠急性GVHD模型。腹腔注射TIRC7及CTLA-4單克隆抗體，并觀察在小鼠急性GVHD模型中，TIRC7及CTLA-4對T細(xì)胞活化及急性GVHD的影響。
　　結(jié)果：①應(yīng)用RT-PCR及wes

3、tern blot方法檢測到急性GVHD患者TIRC7及CTLA-4的表達(dá)。ELISA及q-PCR方法發(fā)現(xiàn)急性GVHD患者TIRC7表達(dá)較正常人升高，在治療后28 d，其表達(dá)均有不同程度下降，且其表達(dá)水平與急性GVHD嚴(yán)重程度呈正比;急性GVHD患者CTLA-4表達(dá)下降，在治療后28 d，其表達(dá)均有不同程度回升，且其表達(dá)水平與急性GVHD嚴(yán)重程度呈反比。②下調(diào)TIRC7表達(dá)后，CTLA-4的表達(dá)下降，STAT3熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光

4、素酶活性顯著下降，STAT3磷酸化程度降低;上調(diào)CTLA-4表達(dá)，TIRC7表達(dá)變化不明顯，STAT3熒光素酶活性顯著升高，STAT3磷酸化程度升高。上調(diào)CTLA-4表達(dá)可顯著抑制T細(xì)胞活化，IFN-γ、IL-17及IL-22等細(xì)胞因子水平均出現(xiàn)不同程度地下降;小干擾質(zhì)粒pGPU6-shTIRC7感染靶細(xì)胞后，T淋巴細(xì)胞活化能力增強(qiáng)，IFN-γ等細(xì)胞因子分泌增多。③成功建立輕-中度及重度急性GVHD小鼠模型。與TIRC7/CTLA-4單

5、一給藥組及未給藥組比較，TIRC7及CTLA-4聯(lián)合給藥組小鼠急性GVHD評分最低，平均生存時(shí)間最長，造血重建恢復(fù)時(shí)間最短。從移植后7d開始，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟、肺臟及腸道等重要臟器均出現(xiàn)不同程度地急性GVHD病理改變。隨著移植時(shí)間的推移，各受累臟器病理改變逐漸嚴(yán)重，其中腸道病理損傷在移植后14 d達(dá)到高峰，肝臟及肺臟病理損傷在移植后21d達(dá)到高峰，以后各臟器損傷程度逐漸減輕。在移植后7d，實(shí)驗(yàn)組小鼠急性GVHD各臟器病理損傷各組間比較均無

6、顯著性差異。而在移植后14d、21d、28 d和35 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TIRC7及CTLA-4聯(lián)合給藥組受鼠肝臟、肺臟及腸道病理損傷程度最輕。隨著移植時(shí)間的遷移，小鼠急性GVHD各受累臟器病理評分逐漸升高，在移植后14-21 d達(dá)到頂峰，然后逐漸降低。在移植后14d、21d、28 d和35 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TIRC7及CTLA-4聯(lián)合給藥組受鼠各臟器病理評分最低。
　　結(jié)論：⑴急性GVHD患者TIRC7表達(dá)升高，且急性GVHD程度越嚴(yán)