BET蛋白抑制劑I-BET151預(yù)防急性移植物抗宿主病的作用研究.pdf

1、一、體外I-BET151對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞/T細(xì)胞功能的作用研究
　　目的:體外條件下，研究I-BET151對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞/T細(xì)胞功能的影響。
　　方法:①C57BL/6(B6，H-2b)小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)的培養(yǎng)。取B6小鼠脛腓骨，沖洗獲得骨髓細(xì)胞，RPMI完全培養(yǎng)基，20ng/ml GM-CSF條件下培養(yǎng)7天，經(jīng)抗CD11c磁珠分選獲得BMDCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度;②I-BET151對(duì)BMDCs細(xì)胞活力的影響。4

2、h、8h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，250nM、500nM、1μM、5μM四個(gè)濃度條件下將BMDCs與研究藥物(I-BET151)或?qū)φ?DMSO)共孵育，通過(guò)AnnexinⅤ和7-AAD流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;③I-BET151對(duì)BMDCs細(xì)胞表面MHC-Ⅱ和共刺激分子表達(dá)的影響。BMDCs靜息和脂多糖(LPS)刺激條件下，與對(duì)應(yīng)濃度I-BET151或DMSO共孵育6小時(shí)后，流式檢測(cè)細(xì)胞CD40、CD80、CD86、PDL1和MHC-Ⅱ分子的表

3、達(dá)水平;④I-BET151對(duì)BMDCs促炎性因子分泌功能的影響。BMDCs與相應(yīng)濃度I-BET151或DMSO共孵育，經(jīng)250ng/ml LPS刺激6h后收集上清，ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α濃度;或刺激3h后收集細(xì)胞提取RNA并逆轉(zhuǎn)成cDNA，real-time PCR技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)基因表達(dá)情況;⑤I-BET151對(duì)BMDCs刺激T細(xì)胞增殖作用的影響。A）通過(guò)體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系，以BAL

4、B/c(H-2d)小鼠脾臟分選的CD90.2+細(xì)胞作為反應(yīng)T細(xì)胞，I-BET151或DMSO孵育并60Co輻照后的B6小鼠BMDCs作為刺激細(xì)胞，共培養(yǎng)96h，3H摻入法檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞增殖效應(yīng)，或CFSE標(biāo)記BALB/c小鼠T細(xì)胞，流式測(cè)定增殖效應(yīng)并通過(guò)AnnexinⅤ檢測(cè)凋亡水平。⑥I-BET151對(duì)T細(xì)胞增殖和功能的直接作用。CFSE標(biāo)記BALB/c小鼠脾臟分選的CD90.2+T細(xì)胞，CD3/CD28條件下與250nM I-BET15

5、1或DMSO共孵育48h，3H摻入法及流式測(cè)定增殖效應(yīng)，并AnnexinⅤ檢測(cè)T細(xì)胞凋亡水平，同時(shí)收集上清，ELISA法檢測(cè)IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10及IL-17濃度。
　　結(jié)果:①經(jīng)體外擴(kuò)增7天及抗CD11c磁珠分選后，每只小鼠骨髓約可獲得25×106個(gè)細(xì)胞，流式檢測(cè)提示CD11c+細(xì)胞比例大于96％;②I-BET151呈劑量、時(shí)間依賴性影響B(tài)MDCs細(xì)胞活力:當(dāng)共孵育時(shí)間低于8h時(shí)，1μM濃度的I-BET15

6、1不會(huì)明顯增加細(xì)胞凋亡比例，但當(dāng)孵育24小時(shí)后，與DMSO對(duì)照組相比，藥物組細(xì)胞凋亡率明顯上升，其中1μM組接近40％（對(duì)照組約15％）;③無(wú)論靜息還是LPS刺激條件下，與I-BET151共孵育6個(gè)小時(shí)后，BMDCs細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86、PDL1和MHC-Ⅱ分子的表達(dá)水平均有明顯降低，下降幅度與藥物劑量正相關(guān)，其中以CD86最為顯著;④I-BET151能顯著抑制LPS刺激后BMDCs分泌炎性因子的能力，同時(shí)I-BET15

7、1的抑制作用具有一定選擇性，IL-12最明顯，IL-6居中，而對(duì)TNF-α的抑制作用相對(duì)溫和;⑤經(jīng)I-BET151孵育后的BMDCs促T細(xì)胞擴(kuò)增的功能明顯受到抑制，抑制程度與藥物濃度正相關(guān);與對(duì)照組相比，T細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有明顯變化。⑥250nMI-BET151對(duì)T細(xì)胞增殖有直接的抑制作用，同時(shí)不增加T細(xì)胞凋亡，并顯著降低T細(xì)胞分泌IFN-γ、 IL-17水平，提高IL-2和IL-4水平。
　　結(jié)論:I-BET151呈劑量和時(shí)間依賴

8、性誘導(dǎo)小鼠BMDCs的凋亡，但1μM濃度條件下孵育8個(gè)小時(shí)不會(huì)顯著增加細(xì)胞凋亡比例;I-BET151能顯著抑制BMDCs細(xì)胞的功能:降低MHC-Ⅱ和共刺激分子的表達(dá)，抑制炎性因子的分泌，降低促T細(xì)胞增殖作用;I-BET151能直接抑制T細(xì)胞的增殖，并改變T細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)譜。
　　二、I-BET151預(yù)防急性移植物抗宿主病的作用及機(jī)制
　　目的:研究移植期短程應(yīng)用I-BET151能否減輕小鼠異基因造血干細(xì)胞移植(allo-

9、HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的嚴(yán)重程度。
　　方法:①以同基因HSCT及BALB/c→B6及B6→BALB/c兩個(gè)小鼠清髓性allo-HSCT后aGVHD模型驗(yàn)證移植期短程(-1d～+5d)應(yīng)用I-BET151是否具有減輕aGVHD的作用。②以B6→BALB/c小鼠allo-HSCT為模型，移植后7天、14天ELISA法測(cè)定受體血清IL-1、IL-6、TNF-α濃度，流式檢測(cè)受鼠脾臟中供體CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量

10、及Treg細(xì)胞比例，組織病理檢測(cè)aGVHD嚴(yán)重程度。
　　結(jié)果:①小鼠同基因移植模型中，移植前-1d至移植后+5天共7次的I-BET151藥物干預(yù)治療不會(huì)影響供體細(xì)胞植入，實(shí)驗(yàn)也未觀察到其它明顯不良反應(yīng);I-BET151在2種小鼠異基因移植模型中，均能明顯減輕移植后aGVHD的嚴(yán)重程度，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠生存期顯著延長(zhǎng);②移植后+7天，I-BET151組小鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著降低，脾臟內(nèi)供體CD4+、CD8+細(xì)

11、胞數(shù)量也較對(duì)照組明顯減少，肝臟、小腸、大腸的aGVHD嚴(yán)重程度顯著低于對(duì)照組，但兩組之間供體嵌合水平無(wú)顯著性差異，Treg細(xì)胞比例也不存在顯著不同。
　　結(jié)論:小鼠allo-HSCT后短程應(yīng)用I-BET151能明顯降低aGVHD嚴(yán)重程度，顯著改善生存率。其作用機(jī)制可能與抑制DCs細(xì)胞功能，降低細(xì)胞因子風(fēng)暴強(qiáng)度，抑制供體效應(yīng)T細(xì)胞增殖有關(guān)。同時(shí)I-BET151不影響供體細(xì)胞植入。
　　三、I-BET151對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞/T細(xì)胞N

12、F-κB信號(hào)通路的影響
　　目的:研究I-BET151對(duì)BMDCs和T細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的作用。
　　方法:①按上述方法獲得B6小鼠BMDCs，500nM I-BET151實(shí)驗(yàn)組及DMSO對(duì)照組，予250ng/ml LPS刺激，Western Blot法動(dòng)態(tài)測(cè)定0h、1/2h、1h、2h、4h細(xì)胞胞漿IκBα降解情況，及0h、1/4h、1/2h、1h ERK蛋白磷酸化水平;②同上，LPS刺激6h，Western Blot

13、法測(cè)定細(xì)胞刺激前后BRD4，RelA和Acetyl-310 RelA表達(dá)水平。③免疫共沉淀法檢測(cè)I-BET151對(duì)BRD4/Acetyl-310 RelA結(jié)合的作用。④B6小鼠CD90.2+T細(xì)胞CD3/CD28孵育24h條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)②、③。
　　結(jié)果:①與對(duì)照組相比，I-BET151對(duì)LPS刺激后BMDCs胞漿中IκBα的降解和重新合成過(guò)程無(wú)明顯干擾作用，同時(shí)對(duì)ERK的磷酸化過(guò)程也無(wú)明顯影響;②LPS或CD3/CD28抗體作用