組蛋白去乙?；敢种茰p輕急性移植物抗宿主病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 通過建立小鼠急性移植物抗宿主病(Acute graft versus host disease，aGVHD)模型，采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA、病理學(xué)等方法，研究組蛋白去乙?；敢种苿℉istione deacety1ase inhibitor，HDACI）對(duì)小鼠GVHD的影響及免疫調(diào)節(jié)作用，探討HADCI減輕GVHD的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、選擇BALB/C(H-

2、2d)雌性小鼠為受鼠，C57BL/6(H-2b)雄性小鼠為供鼠；直線加速器總劑量6.0Gy全身照射(TBI)受鼠后，尾靜脈聯(lián)合輸注供鼠的新鮮脾臟單個(gè)核細(xì)胞(1.8×106)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞(1.6×106)懸液建立小鼠aGVHD模型。移植后小鼠隨機(jī)分為兩組：SAHA治療組：腹腔注射SAHA35g/kg/次，d3，5，7，9，11; DMSO對(duì)照組：腹腔注射DMSO劑量350μ1/kg/次，d3，5，7，9，11。
　　 2、觀察

3、SAHA治療組與DMSO對(duì)照組小鼠aGVHD的發(fā)生率、臨床表現(xiàn)及生存時(shí)間；移植后+2d、+4d、+7d行小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)造血重建，+15天PCR擴(kuò)增外周血基因組Y染色體檢測(cè)骨髓植入是否成功；取瀕死或?qū)嶒?yàn)終點(diǎn)小鼠的肝、脾、小腸組織，行病理學(xué)檢測(cè)。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)每周檢測(cè)SAHA治療組與DMSO對(duì)照組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的百分含量；以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)時(shí)定量PT-PCR檢測(cè)SAHA治療組

4、與DMSO對(duì)照組小鼠Foxp3mRNA的相對(duì)表達(dá)量，采用溶解曲線和瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物特異性。
　　 4、ELISA試劑盒檢測(cè)SAHA治療組與DMSO對(duì)照組小鼠外周血細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growthfactorβ1，TGF-β1)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)

5、準(zhǔn)差（x±SD）表示，多組間比較采用One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法分析，移植后外周血林白細(xì)胞亞群變化采用重復(fù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用LSD或Dunnett’T3多重比較法。采用析因方差分析對(duì)SAHA治療組與DMOS對(duì)照組的Foxp3基因表達(dá)變化差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。一個(gè)因變量與多個(gè)自變量間的線性數(shù)量關(guān)系用linear regression進(jìn)行逐步回歸統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、

6、經(jīng)TBI的BALB/C(H-2d)受鼠，尾靜脈聯(lián)合輸注C57BL/6(H-2b)供鼠的新鮮脾臟、骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液后，移植后+7dWBC均大于1.0×109/L，提示造血重建；SAHA治療組與DMSO對(duì)照組在不同時(shí)間段均出現(xiàn)aGVHD;移植后+15dSAHA治療組與DMSO對(duì)照組外周血PCR產(chǎn)物中均能檢測(cè)到供鼠Y染色體，提示供鼠骨髓細(xì)胞在受體內(nèi)植入成功。
　　 2、SAHA治療組較對(duì)照組小鼠出現(xiàn)aGVHD時(shí)間推遲，程度減輕、生存

7、時(shí)間延長。SAHA治療組生存率與DMSO對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)：SAHA治療組與DMSO對(duì)照組小鼠aGVHD發(fā)生率為100％。aGVHD評(píng)分顯示：SAHA治療組與DMSO對(duì)照組各周aGVHD評(píng)分相比，移植后第一周SAHA治療組與DMSO對(duì)照組差異無顯著性(P＞0.05)，移植后第二周、第三周、第四周SAHA治療組aGVHD評(píng)分均低于DMSO對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)。SAHA治療組與DMSO對(duì)照組小鼠GV

8、HD發(fā)生時(shí)的病理改變基本一致，DMSO對(duì)照組病變較為嚴(yán)重。提示SAHA能有效減輕GVHD的臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重程度。
　　 3、SAHA治療組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞陽性百分率移植后隨時(shí)間呈逐漸遞增趨勢(shì)；DMSO對(duì)照組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞陽性百分率隨時(shí)間呈逐漸遞減趨勢(shì)。移植后+7dSAHA治療組小鼠CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例與DMSO對(duì)照組差異無顯著性(P＞0.05)；移植后+1

9、4d、+21dSAHA治療組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例均高于DMSO對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)。移植后+12d行RT-PCR檢測(cè)SAHA治療組與DMSO對(duì)照組小鼠外周血Foxp3mRNA表達(dá)水平示SAHA治療組Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 4、移植后+12d，SAHA治療組IL-2水平顯著低于DMSO對(duì)照組水平，差異具有顯著性(P＜0.01

10、);SAHA治療組TGF-β水平顯著高于DMSO對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1．MHC不相合的C57BL/6(H-2b)、BALB/C(H-2d)小鼠分別為供、受鼠，受鼠經(jīng)6.0Gy全身照射后，輸注異基因供鼠脾臟、骨髓單個(gè)核細(xì)胞，可以誘導(dǎo)出MHC不相合的造血干細(xì)胞移植后aGVHD小鼠模型；
　　 2．SAHA可延遲aGVHD的發(fā)生，減輕aGVHD的嚴(yán)重程度;
　　 3．S

11、AHA可提高移植后小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例，抑制了前炎癥因子的瀑布效應(yīng)，增強(qiáng)了免疫抑制效應(yīng)，減輕各器官臟器的免疫攻擊效應(yīng)，從而在一定程度上改善了GVHD的臨床癥狀和致死率；
　　 4．SAHA可降低移植后小鼠IL-2的水平，提升TGF-β的水平;
　　 5．SAHA減輕aGVHD，可能是通過提升CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例，提高TGF-β的水平，降低IL-2的水平實(shí)現(xiàn)的。