兩種遺傳性眼病致病基因的定位與突變研究.pdf

1、目的： 先天性白內障為較常見的眼病之一，是兒童失明的主要原因。在先天性白內障患者中，8％—25％是遺傳性的。利用我國的遺傳資源優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)新的白內障致病基因并揭示其突變規(guī)律和特點，用于指導產前基因診斷和遺傳咨詢，將有效地預防和杜絕白內障患兒出生，提高人口質量。對于遺傳性白內障的研究已有悠久的歷史，隨著遺傳學和分子生物學的迅猛發(fā)展，目前遺傳性白內障已有39個基因座被確定，其中19個遺傳性白內障致病基因已被發(fā)現(xiàn)。這19個致病基因分別是

2、10個晶狀體蛋白基因(CRYAA、 CRYAB、CRYBA1、 CRYBA4、 CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYGC、CRYGD和CRYGS)，4個膜蛋白基因(縫隙連結蛋白基因GJA3/GJA8、水通道蛋白基因MIP和內源性膜蛋白基因LIM2)，3個轉錄因子基因(HSF4、PITX3和MAF)，中間絲樣細胞骨架蛋白BFSP2和染色質修飾蛋白基因CHMP4B。但由于先天性白內障種類多，表型又多有交叉，研究較為困難。雖然已經(jīng)

3、確定了多個致病基因，仍然有很多致病基因尚未發(fā)現(xiàn)。本研究收集了5個遺傳性白內障家系，利用先進的分子遺傳學技術及人類基因組計劃的成果，開展了白內障致病基因研究。 諾里病(Norrie disease，ND)是罕見的X連鎖隱性遺傳病，以視網(wǎng)膜出血、剝離導致兒童失明為其主要特征。因沒有很好的治療辦法，ND預后極差。ND致病基因為定位于染色體Xp11.3的NDP基因。迄今為止，在NDP基因相關視網(wǎng)膜病變(ND、X連鎖隱性遺傳的家族性滲出性

4、玻璃體視網(wǎng)膜病變、Coats病和早熟性視網(wǎng)膜病)中，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NDP基因的80種突變。本研究收集了一個中國人諾里病家系，對該家系進行了致病基因突變的鑒定。 材料和方法： 收集5個遺傳性白內障家系，根據(jù)家族史、臨床癥狀及體征進行準確的臨床診斷，繪制系譜圖。與患者及其家屬簽署知情同意書后，采集家系成員外周血5—10ml，—70℃凍存?zhèn)溆谩?根據(jù)美國國立圖書館數(shù)據(jù)庫中的標準序列，對染色體22q11.2—12.15區(qū)域

5、內的4個已知白內障致病基因(CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和CRYBA4)、染色體16q22.1區(qū)域內的1個已知白內障致病基因HSF4、染色體1p36.23—36.21區(qū)域內的7個候選基因(PTCHD2、KAZRIN、CASP9、SPEN、RSC1A1、PRMD2和PAX6)進行PCR引物設計，擴增這些基因的全部外顯子及外顯子/內含子交界區(qū)。PCR產物純化回收后，直接測序。對于家系4中發(fā)現(xiàn)的PTCHD2基因可能致病突變，PCR

6、擴增家系成員及268個無關正常個體的該基因第20個外顯子與部分內含子，限制性內切酶ApalⅠ消化PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段；使用高保真DNA聚合酶和位于PTCHD2基因外顯子18及外顯子21的一對引物，PCR擴增患者基因組DNA片段，克隆到pcDNA3.1質粒并構建PTCHD2微基因(minigene)，轉染COS—7細胞和HeLa細胞后提取總RNA，利用RT-PCR檢測RNA剪接情況。對于在家系5中發(fā)現(xiàn)的可能致病突變HSF

7、4基因c．356G>A(p.Arg119His)，設計針對突變的錯配引物，采用巢式PCR擴增家系成員及100名無關正常對照個體的HSF4基因外顯子3中含有突變點的DNA片段，限制性內切酶NsbⅠ消化PCR產物，8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切片段。 收集1個諾里病家系，根據(jù)家族史、臨床體征及眼科B型超聲波檢查進行臨床診斷。采集家系成員外周血標本，常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA。設計并合成3對PCR引物，通過PCR擴增患者及其母親ND

8、P基因的全部3個外顯子與外顯子/內含子交界區(qū)，PCR產物直接測序。針對可能致病突變，通過PCR產物限制性內切酶分析和PAGE分析驗證對家系所有13名成員進行突變鑒定。確定致病突變后，對家系中一名懷孕的突變攜帶者，采集其胎兒絨毛、提取胎兒DNA。在NPD基因附近染色體區(qū)域選擇2個微衛(wèi)星標記，設計PCR引物擴增胎兒及其他家系成員微衛(wèi)星片段，通過8％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳及銀染分析PCR等位片段基因型。最終通過單體型分析及限制性內切酶分析確定

9、胎兒是否攜帶致病基因，進行產前基因診斷。 結果： 臨床檢查表明5個遺傳性白內障家系的表型包括多形態(tài)性白內障，后極性白內障及核性白內障。調查確定五個家系成員共計212人，其中64人患病(男性患者34人，女性患者30人)?，F(xiàn)存家系成員共計201人，患者55人(男性患者30人，女性患者25人)。5個家系均符合常染色體顯性遺傳。 25個位點的微衛(wèi)星標記兩點連鎖分析結果表明，家系1和2在全部檢測位點均未發(fā)現(xiàn)連鎖。家系3在微

10、衛(wèi)星標記D22S689可獲得最大LOD值2.71(θ=0時)，提示該家系表型可能與染色體22q11.2—12.1區(qū)域連鎖。家系4在微衛(wèi)星標記D1S1151可獲得最大LOD值3.36(θ=0時)，提示該家系表型與染色體1p36.2的位點連鎖；通過單倍型分析確定致病基因在微衛(wèi)星標記1pTTTC(基因組位置8956145)和1pCAAA(基因組位置16294562)之間7.3Mb的區(qū)域內；參考已報道的致病基因范圍，可以將該位點的致病基因范圍縮

11、短至微衛(wèi)星標記D1S228與1PCAAA之間2.4Mb的區(qū)域內。家系5在微衛(wèi)星標記D16S3085可獲得最大LOD值2.63(θ=0時)，提示該家系致病基因在染色體16q22.1區(qū)域內。 針對各家系致病基因定位范圍內的已知或候選基因進行突變篩查。在家系3中，未發(fā)現(xiàn)CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和CRYBA4四個已知致病基因的致病突變。在家系4中，對PTCHD2、KAZRIN、CASP9、SPEN、RSC1A1、PRMD

12、2、PAX6七個候選基因進行測序，發(fā)現(xiàn)PTCHD2基因第20個內含子中第5個堿基由G變?yōu)門，即INV20+5G>A。其它基因沒有發(fā)現(xiàn)有意義的改變。限制性內切酶分析結果顯示，家系4所有患病成員都攜帶該變化，家系成員中的正常個體與268個無關個體均不含該改變?；颊逷TCHD2微基因克隆后，轉染HeLa和COS—7細胞，RT-PCR顯示PTCHD2基因的INV20+5G>A改變不影響RNA的剪接。在家系5中，患者HSF4基因測序結果表明該基因

13、第三外顯子發(fā)生c．356G>A，使蛋白上高度保守的119位精氨酸替換成組氨酸。限制性內切酶分析顯示該家系中所有患病成員都攜帶這個突變，100個無關正常個體均不含有該突變。 諾里病家系成員現(xiàn)存13名，患者1名(先證者)。疾病傳遞符合X連鎖隱性遺傳。先證者及其母親的NDP基因測序結果顯示二人都攜帶NDP基因突變c．220C>T(p.Arg74Cys)，且先證者為該突變的半合子，其母為該突變的雜合攜帶者。酶切鑒定表明家系中另外4名表型

14、正常的女性個體(Ⅲ3、Ⅳ3、Ⅲ5和Ⅱ5)均為該突變的攜帶者。微衛(wèi)星標記單體型分析及限制性內切酶分析顯示胎兒為女性，且為致病突變攜帶者。 結論： 1、本文收集到常染色體顯性遺傳的白內障家系5個。其白內障表型不僅在不同家系間有不同，同一家系的不同個體間也有不同，表明國人中常染色體顯性遺傳性白內障存在表型異質性。同時，不同基因與遺傳性白內障的發(fā)生有關，表明了遺傳性白內障的遺傳異質性。 2、在家系1與家系2中，通過連鎖分

15、析排除了全部19個已知遺傳性白內障致病基因的15位點及其它10個位點，提示存在未知白內障致病位點，有待進一步研究。 3、家系3的兩點連鎖分析結果提示其致病基因可能定位在染色體22q11.2—12.1區(qū)域內，但在4個已知致病基因內均未發(fā)現(xiàn)致病突變，提示可能存在未知突變機制(包括存在其它位點)。 4、家系4的致病基因定位于染色體1p36區(qū)域，參考已報道的致病基因范圍，將致病基因所在的范圍縮短至微衛(wèi)星標記D1S228與1pCA

16、AA之間2.4Mb的區(qū)域內；對該區(qū)域內PTCHD2、KAZRIN、CASP9、SPEN、RSC1A1、PRMD2和PAX6七個可能候選基因測序尚未發(fā)現(xiàn)致病突變。 5、在家系5中，HSF4基因發(fā)生的c．359G>A(p.Arg119His)突變是該家系的致病突變，此突變是HSF4基因上新的致病突變。再次證實了HSF4基因與遺傳性白內障的相關性。 6、首次在中國人諾里病家系中發(fā)現(xiàn)了NDP基因錯義突變c．220C>T，該突變與