兩個中國遺傳性聾家系的致病基因研究.pdf

1、第一部分、一個母系遺傳性聾家系的致病基因研究
　　 目的：研究一個五代母系遺傳性聾大家系的遺傳學(xué)病因及發(fā)病機(jī)制，闡明該家系成員耳聾的機(jī)制，為遺傳性聾的防治提供理論依據(jù)。
　　 方法：經(jīng)耳聾先證者獲悉一遺傳性聾大家系，經(jīng)家系調(diào)查采集詳細(xì)的臨床及聽力學(xué)資料，并在簽署知情同意書后采集靜脈血。由靜脈血提取全基因組DNA，對母系成員的線粒體基因組全序列及常見耳聾基因GJB2經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和測序進(jìn)行檢測。對檢測到的線粒體DNA耳

2、聾相關(guān)突變應(yīng)用焦磷酸測序進(jìn)行異質(zhì)性定量，分析突變的異質(zhì)性比例與耳聾程度的相關(guān)性。對突變位點(diǎn)行物種間進(jìn)化保守性分析。在相同遺傳背景的200名正常聽力對照和806名散發(fā)感音神經(jīng)性聾患者中進(jìn)行突變篩查。同時建立耳聾患者和正常聽力對照的淋巴細(xì)胞系，提取細(xì)胞的線粒體總RNA，采用Northern blot檢測基因突變后tRNA水平的變化，并進(jìn)行線粒體基因的蛋白合成和細(xì)胞耗氧量測量。
　　 結(jié)果：該家系符合母系遺傳規(guī)律，耳聾的發(fā)生與使用氨基

3、糖甙類抗生素?zé)o關(guān)，表現(xiàn)為雙側(cè)對稱、遲發(fā)性、進(jìn)行性感音神經(jīng)性聾，以高頻聽力損失為主，逐漸累積全頻，常伴高調(diào)耳鳴。患者顳骨高分辨率CT無明顯異常，未伴隨明顯的其他系統(tǒng)疾病，屬于非綜合征型聾。線粒體基因組全序列分析顯示母系成員屬于同一線粒體單倍型Z，共存在43種堿基改變，其中T12201C為異質(zhì)性突變，位于tRNA-His基因二級結(jié)構(gòu)的接受臂，使堿基配對由A-U變?yōu)锳-C，該位點(diǎn)在多物種間高度保守，突變異質(zhì)性比例與耳聾發(fā)病年齡和嚴(yán)重程度存在相

4、關(guān)性。其余堿基改變無特殊病理意義。在200名聽力正常對照和806名散發(fā)感音神經(jīng)性聾患者中未篩查到該突變。常見耳聾基因GJB2篩查顯示部分家系成員包括患者和聽力正常者均攜帶235delC雜合突變。成功構(gòu)建患者和正常聽力對照的淋巴細(xì)胞系，Northern blot分析顯示突變后tRNA-Hi s水平較正常對照減少75％。線粒體基因的翻譯產(chǎn)物較正常對照減少47％，細(xì)胞總耗氧率較正常對照減少36％，差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：線粒

5、體基因tRNA His T12201C異質(zhì)性突變?yōu)樵摷蚁党蓡T耳聾的主要分子基礎(chǔ)，突變異質(zhì)性比例與耳聾發(fā)病年齡和嚴(yán)重程度存在一定相關(guān)性。T12201C突變造成tRNA代謝異常，tRNA His的水平明顯減少，使線粒體蛋白合成和呼吸功能顯著降低，ATP合成減少，活性氧族增加，最終導(dǎo)致耳聾。
　　 第二部分、一個Waardenburg綜合征家系的致病基因研究
　　 目的：研究一個中國Waardenburg綜合征家系的臨床表型特

6、征和遺傳學(xué)致病基因，及其基因型和表型間的關(guān)系。
　　 方法：經(jīng)耳聾先證者獲悉一個綜合征型聾家系，進(jìn)行家系調(diào)查、聽力學(xué)檢測和全身檢查，并在簽署知情同意書后采集靜脈血5ml，提取全基因組DNA。分析整理臨床資料，繪制系譜圖，判斷遺傳方式。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增候選基因MITF全部9個外顯子及其側(cè)翼序列，PCR產(chǎn)物純化測序后與參考序列比對，尋找突變和多態(tài)改變。對發(fā)現(xiàn)的突變分析氨基酸及編碼蛋白質(zhì)的改變，并進(jìn)行氨基酸多物種間保守性分析。同時對所

7、有家系成員進(jìn)行常見耳聾基因GJB2、線粒體DNA12S rRNA的測序篩查。在100名相同遺傳背景的正常聽力對照中對發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行測序篩查。
　　 結(jié)果：該家系診斷為Waardenburg綜合征Ⅱ型，主要臨床表現(xiàn)為棕褐色雀斑、早白發(fā)、虹膜異色、先天性感音神經(jīng)性聾。根據(jù)系譜圖判斷為常染色體顯性遺傳方式，但家系中不同個體的表型存在明顯差異。MITF基因外顯子全測序在第8外顯子發(fā)現(xiàn)C.[742-743delAAinsT；746-747

8、delCA]雜合突變，12名家系成員攜帶該突變，與臨床表型共分離。突變導(dǎo)致MITF蛋白第248位氨基酸由賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TAG，正常時419個氨基酸殘基的蛋白截短為247個氨基酸，喪失了蛋白重要的功能結(jié)構(gòu)域bHLH，導(dǎo)致單倍劑量不足。該氨基酸位點(diǎn)在多物種間高度保守。同時發(fā)現(xiàn)先證者不僅攜帶MITF基因的雜合突變，而且攜帶GJB2基因c。[109G>A]+[235delC]復(fù)合雜合致病突變。其他家系成員無GJB2基因雙致病突變，所有成

9、員線粒體DNA12S rRNA均未發(fā)現(xiàn)致病突變。100名聽力正常對照中未發(fā)現(xiàn)MITF基因第8外顯子任何突變或多態(tài)改變，也未發(fā)現(xiàn)GJB2基因c。[109G>A]+[235delC]復(fù)合雜合致病突變。
　　 結(jié)論：Waardenburg綜合征Ⅱ型臨床表型多變，該家系成員的主要遺傳學(xué)病因為MITF基因c.[742-743delAAinsT；746-747delCA]雜合突變，這是一個新的WS2復(fù)雜突變。先證者同時存在MITF基因突變和