一個(gè)中國(guó)漢族遺傳性多發(fā)性外生性骨疣家系和三個(gè)反常性痤瘡家系的致病基因突變研究.pdf

1、前言
　　 遺傳性多發(fā)性外生性骨疣(hereditary multiple exostoses,HME)是一種常染色體顯性遺傳病,以骨骼系統(tǒng)多發(fā)性外生性骨疣為特征,常見(jiàn)于長(zhǎng)骨干骺端,偶見(jiàn)于長(zhǎng)骨骨干。骨疣通常發(fā)生在膝關(guān)節(jié)(70％)、肱骨(50％)、前臂(50％)、肩胛骨(50％)、踝關(guān)節(jié)(25％)等部位,呈對(duì)稱性分布。HME發(fā)病率在歐洲人群中約1/10萬(wàn),在華盛頓人群中≥1/5萬(wàn)。HME外顯率為95％。約90％的HME患者有受累父

2、/母,約10％有新生基因突變。HME具有遺傳異質(zhì)性,目前研究認(rèn)為該病至少與三個(gè)基因相關(guān):定位在8q24.11-q24.13的EXT1、定位在11p12-p11的EXT2、定位在19p的EXT3,其中EXT1、EXT2已被克隆。此外,HME可能存在修飾EXT1或EXT2突變效果的二次突變,由此與已知EXT基因具有相同羧基端編碼產(chǎn)物的EXTL基因家族也有可能是HME的候選致病基因,包括有三個(gè)成員:定位在1p36.1的EXTL1、定位在1p1

3、1-p12的EXTL2、定位在8p12-p22的EXTL3。迄今為止,尚未在EXT3和EXTL基因家族發(fā)現(xiàn)HME致病突變。HME致病突變目前只發(fā)現(xiàn)于EXT1和EXT2基因,其中EXT1突變占56％～78％,EXT2突變占21％～44％。
　　 本文以1個(gè)中國(guó)漢族HME家系為研究對(duì)象,首先利用單體型分析進(jìn)行了致病基因定位,然后對(duì)候選基因進(jìn)行DNA傳統(tǒng)測(cè)序來(lái)篩查突變,最后通過(guò)限制性酶切多態(tài)性分析對(duì)突變進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 材料與

4、方法
　　 1、家系材料
　　 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基因組學(xué)教研室收集的1個(gè)中國(guó)漢族HME家系,癥狀與HME既往報(bào)道相符。在簽署書面的知情同意書后,對(duì)家系中12名成員采集血樣(其中患者5例,男2例、女3例)。
　　 2、單體型分析
　　 常規(guī)酚-氯仿抽提法提取家系成員的外周血DNA。在EXT1和EXT2基因內(nèi)部分別選取了2個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記,PCR擴(kuò)增后經(jīng)8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和常規(guī)銀染,讀取每個(gè)個(gè)體的標(biāo)記

5、基因型。再根據(jù)個(gè)體基因型和系譜中的親緣關(guān)系,按照孟德?tīng)栠z傳定律推導(dǎo)出同一條染色體上不同標(biāo)記構(gòu)成的單體型。
　　 3、候選基因DNA傳統(tǒng)測(cè)序
　　 根據(jù)單體型分析確定候選基因后,PCR擴(kuò)增患者候選基因所有外顯子,PCR產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行DNA傳統(tǒng)測(cè)序。
　　 4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析
　　 根據(jù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變?cè)O(shè)

6、計(jì)1個(gè)錯(cuò)配引物,錯(cuò)配堿基與包括突變堿基在內(nèi)的鄰近堿基構(gòu)成一個(gè)ScaI限制性酶切位點(diǎn)。對(duì)家系全體成員及100名無(wú)關(guān)正常個(gè)體使用錯(cuò)配引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)ScaI消化,消化產(chǎn)物經(jīng)8％中性聚丙烯酰胺凝膠電泳和常規(guī)銀染檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、單體型分析
　　 8號(hào)染色體的EXT1基因可能為該家系候選致病基因。
　　 2、DNA傳統(tǒng)測(cè)序
　　 患者EXT1基因第10外顯子存在雜合缺失突變c.1

7、897delC,該突變導(dǎo)致編碼的氨基酸從第633位密碼子開(kāi)始移碼,在編碼了9個(gè)氨基酸之后產(chǎn)生終止密碼,可能產(chǎn)生一個(gè)含有641個(gè)氨基酸的截短蛋白(p.Leu633TyrfsX10)。對(duì)該家系全體成員進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)該變異與疾病表型共分離,家系中所有患者都存在該變異,而正常個(gè)體都沒(méi)有。
　　 3、RFLP分析
　　 ScaI酶切產(chǎn)物電泳可見(jiàn),家系中患者具有284bp、250bp和34bp三種長(zhǎng)度的片段:而家系中正常個(gè)體及100

8、名無(wú)關(guān)正常個(gè)體只有284bp片段,即沒(méi)有ScaI位點(diǎn),說(shuō)明家系中正常人及無(wú)關(guān)正常個(gè)體不攜帶c.1897delC突變,此突變不是SNP。
　　 結(jié)論
　　 首次在HME家系中檢測(cè)到雜合缺失突變EXT1 c.1897delC(p.Leu633TyrfsX10),此突變是該中國(guó)漢族HME家系的致病突變。
　　 前言
　　 反常性痤瘡(acne inversa,AI)以往被稱為化膿性汗腺炎(hidradeniti

9、s suppurativa,HS),以反復(fù)發(fā)生皮膚膿腫,竇道及瘢痕形成為特征性表現(xiàn)。病情反復(fù)發(fā)作,此起彼伏,遷延不愈。與尋常性痤瘡不同,該病病變主要累及腋前線、乳房下區(qū)、外生殖器區(qū)、肛周等毛囊皮脂腺單位、頂泌汗腺分布豐富的部位。據(jù)國(guó)外報(bào)道,該病的發(fā)病率估計(jì)為1:100～600。AI病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為是由于毛囊漏斗部的上皮細(xì)胞過(guò)度角化增生造成毛囊口及皮脂腺的阻塞,皮脂排出不暢,之后繼發(fā)細(xì)菌感染引起。近年來(lái),遺傳因素在其發(fā)病過(guò)

10、程中所起的作用受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注,家系研究也表明其遺傳方式符合單基因常染色體顯性遺傳。目前,人類孟德?tīng)栠z傳(MendelianInheritance in Man)數(shù)據(jù)庫(kù)將家族性AI(acne inversa,familial)收錄為MIM％142690。迄今為止,報(bào)道的致病基因座有3個(gè),分別位于1p21.1-1q25.3,6q25.1-25.2以及19號(hào)染色體D19S911與D19S1170之間約12Mb的區(qū)間,但致病基因尚未明確。

11、
　　 基于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系(以下簡(jiǎn)稱醫(yī)科院基礎(chǔ)所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系)的前期工作基礎(chǔ),本文對(duì)三個(gè)分別來(lái)自中國(guó)河北省、河南省和英國(guó)的AI家系進(jìn)行了致病基因突變研究。
　　 材料與方法
　　 1、家系材料
　　 醫(yī)科院基礎(chǔ)所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系收集到的三個(gè)AI家系分別來(lái)自中國(guó)河北省、河南省和英國(guó),均符合常染色體顯性遺傳。
　　 2、DNA傳統(tǒng)測(cè)序
　　 在中國(guó)兩個(gè)AI家系定位的連鎖區(qū)

12、域chr19:35,000,000-40,890,000內(nèi)的212個(gè)基因中篩選候選基因,PCR擴(kuò)增候選基因5'-UTR、編碼外顯子、3'-UTR,PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA傳統(tǒng)測(cè)序。
　　 3、高通量測(cè)序
　　 提取3個(gè)AI家系中明確診斷的患者各一位的外周血DNA,送至Roche NimbleGen公司采用Sequence Capture 385K Array 捕獲序列,繼而使用Roche公司454測(cè)序儀(RochGS FLX

13、 sequencer)測(cè)序3個(gè)家系聯(lián)合定位區(qū)域chr19:20,916,746-50,538,495的全部外顯子組。
　　 4、高通量測(cè)序結(jié)果分析
　　 使用IGV1.4.2軟件閱讀Roche 454AllDiffsReg.primary_target_region.gff3、454HCDiffsReg.primary_target_region.gff3、454AlignmentCoverage.igv文件；使用Ult

14、raEdit軟件閱讀454AllDiffs.txt、454HCDiffs.txt文件,隨時(shí)比對(duì)不同于UCSC Feb.2009human reference sequence(GRCh37/hg19)的測(cè)序結(jié)果,篩選可能致病改變。
　　 5、高通量測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證
　　 使用DNA傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果中的可能致病改變。針對(duì)經(jīng)DNA傳統(tǒng)測(cè)序證明確實(shí)存在的可能致病突變,設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增全部家系成員的相應(yīng)片段,對(duì)片段

15、進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳長(zhǎng)度分析、或RFLP分析、或高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)分析,判斷該變異是否與疾病表型共分離。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、DNA傳統(tǒng)測(cè)序結(jié)果
　　 完成了25個(gè)基因的DNA傳統(tǒng)測(cè)序,均未發(fā)現(xiàn)致病改變,僅發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)已知的SNP,和FLT3LG基因第6外顯子中1個(gè)尚未報(bào)到過(guò)的SNP c.502C>G(以起始密碼ATG之A為第1位)。