遺傳性耳聾家系的基因定位及基因診斷研究.pdf

1、第一章：兩個Waardenburg綜合征Ⅳ型家系的臨床特征及相關(guān)基因突變研究
　　 目的：收集了兩個Waardenburg綜合征Ⅳ型家系(WS01家系和WS02家系)，擬對其進行臨床診斷分析和基因突變檢測研究。
　　 方法：對兩個家系成員進行了病史采集、臨床聽力學(xué)分析及體格檢查，并進行了Waardenburg綜合征Ⅳ型相關(guān)基因(EDNRB、EDN3、SOX10基因)的外顯子測序以篩查致病突變。
　　 結(jié)果：WS0

2、1家系一共兩代5人，先證者與其大姐分別為Waardenburg綜合征Ⅳ型和waardenburg綜合征Ⅱ型患者，兩位患者均表現(xiàn)為左眼虹膜異色，先證者伴有先天性巨結(jié)腸；WS02家系先證者為1歲女童，Waardenburg綜合征Ⅳ型患者，雙側(cè)虹膜異色，伴有先天性巨結(jié)腸。三位患者聽力學(xué)檢查均提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，眼底檢查呈現(xiàn)晚霞狀改變，無皮膚毛發(fā)顏色異常及內(nèi)眥移位。WS01家系的先證者及其大姐均檢測到有SOX10基因的2號外顯子上存在c

3、.254G>A(P.Trp85X)雜合突變，而先證者的母親(正常人)SOX10基因的2號外顯子上也檢測到有c.254G>A雜合突變，多次測序后發(fā)現(xiàn)突變峰的高度僅為正常峰高度的1/3；WS02家系的先證者SOX10基因的4號外顯子測序發(fā)現(xiàn)一個剪接位點的雜合突變c.698-2A>T，患者的父母未攜帶此突變。用直接測序法對100例不相關(guān)的正常人進行SOX10基因突變c.254G>A和c.698-2A>T的檢測，結(jié)果沒有檢測到相同突變。

4、　　 結(jié)論：1.本研究所報道的waardenburg綜合征Ⅳ型病例屬國內(nèi)首次報道；2.SOX10基因突變位點c.254G>A(P.Trp85X)和c.698-2A>T屬于新發(fā)突變位點，目前國內(nèi)外尚無此突變位點的報道；3.SOX10基因可能存在鑲嵌體。
　　 第二章：一個常染色體顯性遺傳性耳聾大家系的致病位點定位研究
　　 目的：為明確一來自湖南張家界地區(qū)非綜合征型常染色體顯性遺傳耳聾家系的基因診斷，對此家系進行了初步的

5、定位及候選基因篩查工作。
　　 方法：收集了一4代人的常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾家系，家系中一共有41人，由于家系發(fā)病年齡在20-30歲左右，故將未到達(dá)發(fā)病年齡的家系成員排除在研究外。本研究共對家系中14名成員(其中包括7名患者和7名正常人)進行了臨床診斷分析、遺傳基因定位及基因篩查研究。首先，根據(jù)家系耳聾患者的臨床表型及遺傳方式，對家系成員進行了最常見的非綜合征型顯性耳聾基因COCH、EYA4、GJB2、GJB3基因的直接

6、測序排查及與家系表型相似的耳聾致病位點的排除定位分析。排除分析后應(yīng)用Illumina linkage芯片對該家系進行了全基因組掃描以初步定位致病區(qū)間，在初步定位的區(qū)間內(nèi)挑選MARKER進行精細(xì)定位。最后，對精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的已知耳聾基因進行直接測序篩查家系致病突變。
　　 結(jié)果：家系臨床特征表現(xiàn)為：語后聾，20-30歲左右發(fā)病，發(fā)病初期表現(xiàn)為耳鳴及高頻聽力下降，40歲左右進行性發(fā)展為雙耳重至極重度聾。排除COCH、EYA4、GJB

7、2、GJB3基因及相關(guān)耳聾致病位點后進行了全基因組掃描及微衛(wèi)星精細(xì)定位，經(jīng)過多點Lod值的計算及單體型分析最終將該家系的致病區(qū)間定位在chr1：P34.2-P34.3(D1S2656；D1S3721)約8.21cM的區(qū)間，在D1S2729和D1S2892marker得到了最大多點lod值3.1，此區(qū)間與已定位的DFNA2位點重疊，對DFNA2位點上兩個已克隆耳聾基因GJB3和KCNQ4進行直接測序篩查后未發(fā)現(xiàn)與家系相關(guān)的致病突變。

8、>　　 結(jié)論：DFNA2位點上可能存在其他的基因參與該家系耳聾的發(fā)生。
　　 第三章：Il lumina Goldengate384k高通量耳聾基因篩查芯片的設(shè)計、研發(fā)及其對遺傳性耳聾家系的檢測
　　 目的：設(shè)計、制備Illumina Goldengate384K高通量耳聾基因篩查芯片，采用此芯片以期在更廣的范圍內(nèi)對已知耳聾突變位點進行篩查和對耳聾大家系進行己定位耳聾位點的排除定位。
　　 方法：芯片設(shè)計原則：

9、由于芯片的引物探針需間隔60bp以上才能確保準(zhǔn)確的雜交，故我們在找出所有已知耳聾相關(guān)突變位點的基礎(chǔ)上，首先挑選出目前文獻(xiàn)報道有2篇以上的突變位點，再依據(jù)60bp距離盡可能多的將剩余的突變位點設(shè)計在芯片上，一共選取了240個耳聾相關(guān)突變位點，包括77個顯性突變位點及163個隱性突變位點。另外，我們在亞洲人群中報道的己克隆耳聾相關(guān)基因中，選取了144個SNP位點，整張芯片共384個檢測點。該芯片可進行已知耳聾相關(guān)突變位點的高通量篩查和耳聾相

10、關(guān)家系的初步排除定位。我們通過對465例DNA樣本進行Illumina GoldenGate384K高通量耳聾基因芯片篩查，統(tǒng)計芯片Call rate、對其準(zhǔn)確性進行了驗證、對芯片中144個SNP位點的等位基因頻率進行了統(tǒng)計分析及對芯片的排除定位連鎖分析進行了驗證。對90個耳聾家系的135例DNA樣本的芯片檢測結(jié)果進行分析。
　　 結(jié)果：1.芯片總的Call rate為96.32％，Call rate達(dá)到100％的位點有110個

11、；2.對芯片上的GJB2_235delC突變檢測點進行了準(zhǔn)確性驗證后發(fā)現(xiàn)芯片此檢測點的假陽性率為3/97(3.1％)，假陰性率為0；3.芯片中有8個基因的19個SNP位點的最小等位基因頻率小于0.1(10％)；4.芯片對本研究中一耳聾家系的定位位置與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描定位的位置相同，認(rèn)為該芯片能較準(zhǔn)確的進行耳聾相關(guān)基因的排除定位連鎖分析；5.在此次患者樣本檢測中共有12個基因的31個突變檢測位點在耳聾家系患者中有檢出，剩余有189個檢

12、測位點在此次檢測中無檢出。這189個耳聾突變位點在中國耳聾家系人群中則可能屬于罕見的突變位點。對90個耳聾家系的135例DNA樣本的芯片檢測結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)GJB2_235delC、SLC26A4_IVS7-2A>G等突變位點與目前國內(nèi)報道的突變檢出率相似，PJVK_988delG(57.36％)、SLC26A4_Gly497Ser(7.14％)等既往報道中的非熱點突變在此次耳聾家系患者中也具有很高的突變檢出率。
　　 結(jié)論：

13、研究所設(shè)計的高通量耳聾基因篩查芯片可以更廣范圍內(nèi)對一些不常檢測的耳聾相關(guān)突變位點進行檢測及可對耳聾家系進行初步排除定位。PJVK_988delG(57.36％)、SLC26A4_Gly497Ser(7.14％)等既往報道中的非熱點突變在耳聾家系患者中具有很高的突變檢出率，其是否是多肽或是與檢測人群不同有關(guān)還是芯片檢測的準(zhǔn)確性問題?我們將在下一步工作中對有檢出的突變位點進行準(zhǔn)確性驗證，并對芯片設(shè)計內(nèi)容進行調(diào)整，剔除突變頻率較低、Call