分枝狀肽小核酸分子輸遞系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、制備及其細(xì)菌內(nèi)遞藥特性的研究.pdf

1、目的：
　　耐藥細(xì)菌感染已成為臨床抗感染治療中極為棘手的問題，是造成重癥感染死亡的首要原因，尤其是多重耐藥、全耐藥的超級細(xì)菌感染，臨床可選的抗菌藥物十分有限。更令人擔(dān)憂的是，耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了新抗菌藥物的研發(fā)速度。因此，尋找和研制對抗耐藥細(xì)菌的新策略和新藥物，已成為當(dāng)今世界各國醫(yī)學(xué)科學(xué)家當(dāng)務(wù)之急的研究課題。
　　抗菌藥物的經(jīng)典研究思路是以細(xì)菌蛋白為靶點(diǎn)，而反義抗菌策略則是以細(xì)菌內(nèi)致病、耐藥、生存等關(guān)鍵基因?yàn)榘悬c(diǎn)

2、，采用反義小核酸分子阻斷這些基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制或者殺滅細(xì)菌的作用。與經(jīng)典的抗菌藥物相比，反義抗菌分子具有靶標(biāo)基因明確、藥物分子設(shè)計(jì)容易、特異性強(qiáng)、不易誘導(dǎo)耐藥、能夠快速規(guī)?；苽?、研發(fā)周期短等優(yōu)點(diǎn)。因而反義抗菌策略被認(rèn)為是抗耐藥菌感染最有希望的突破口。采用反義抗菌策略，我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)細(xì)菌靶標(biāo)基因，篩選出多個(gè)反義抗菌分子，并在離體和感染動(dòng)物模型上證實(shí)了這些反義抗菌分子能夠有效阻斷細(xì)菌基因，從達(dá)起到逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性、抑

3、制或殺滅細(xì)菌的作用。然而，反義核酸是一類親水性強(qiáng)，分子量大，荷負(fù)電荷的分子，祼的反義核酸分子很難穿透細(xì)菌胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，這已成為制約反義抗菌藥物進(jìn)一步開發(fā)研究的瓶頸。因此，研制高效向細(xì)菌內(nèi)遞送小核酸藥物的遞送系統(tǒng)，是反義抗菌藥物研究領(lǐng)域重要的課題，也是實(shí)現(xiàn)反義抗菌藥物向臨床應(yīng)用過渡必須突破的難點(diǎn)。
　　理想的反義抗菌分子遞送載體應(yīng)當(dāng)能安全高效的將反義抗菌分子遞送至細(xì)菌內(nèi)，使其選擇性阻斷細(xì)菌靶基因的表達(dá)而發(fā)揮抗菌作用。已有文獻(xiàn)研

4、究表明，透膜肽能夠通過共價(jià)偶聯(lián)的方式將小核酸分子遞送至細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮抗菌作用，但這種策略受載藥量低、連接臂設(shè)計(jì)及合成困難等因素的限制而難以推廣。有文獻(xiàn)報(bào)道，與線性結(jié)構(gòu)的多肽相比，分枝狀多肽因具有廣闊的分子內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，更有利于小核酸分子的包裹和遞送。然而分枝狀多肽能否與反義抗菌分子以非共價(jià)方式形成納米粒從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)遞藥，目前尚無研究報(bào)道?；卮鹕鲜鰡栴}至少應(yīng)該明確：①哪些因素影響分枝狀多肽/小核酸藥物納米粒的形成？②分枝狀多肽中哪些因素與納米粒

5、在細(xì)菌遞送效率直接相關(guān)？③細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞對納米粒的攝取機(jī)制有何不同？④不同的細(xì)菌如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或者敏感菌與耐藥菌對納米粒的攝取特點(diǎn)是否不同？本課題針對上述未知領(lǐng)域，以含有四個(gè)末端分支的多肽為基本結(jié)構(gòu)，以亮氨酸-色氨酸-精氨酸為基本重復(fù)序列，考慮電荷數(shù)目及分布、親水與疏水、羥基氨基酸、組氨酸及脂質(zhì)輔助成分等影響因素，設(shè)計(jì)七條分支狀多肽（Dendritic Poly-peptide, DPP），以第一代反義核酸分子硫代

6、反義寡核苷酸（PS-ODN）為模型藥物，系統(tǒng)研究分枝狀肽-反義核酸分子納米粒（ODN/DPP納米粒）的制備及其影響因素，深入探討納米粒細(xì)菌內(nèi)遞藥特性及可能的遞送機(jī)制，為反義抗菌技術(shù)的發(fā)展提供新的依據(jù)。
　　方法：
　　1. DPP的設(shè)計(jì)與合成
　　我們共設(shè)計(jì)了七條分枝狀多肽，命名為 DPP1-7。重點(diǎn)考察以下因素對納米粒制備和細(xì)菌內(nèi)遞藥的影響：①親水性與兩親性：DPP1，DPP4，DPP5和DPP6為親水性 DPP，而

7、 DPP2，DPP3，DPP7為兩親性 DPP；②電荷分布：在 DPP1和DPP6分枝中，正電荷分布分別呈兩端分布和平均分布，在 DPP2疏水分枝和親水分枝中，電荷分布呈一疏一密，而DPP3中電荷集中分布在親水枝。③羥基氨基酸：DPP1和DPP6中含有亮氨酸和色氨酸，而在DPP4和DPP5中用含有羥基的絲氨酸和蘇氨酸代替。④組氨酸：DPP7中用組氨酸來替換 DPP3中親水端中的賴氨酸。DPP采用十二通道半自動(dòng)多肽合成儀合成，并通過LC-

8、3000高效液相色譜儀純化， API-150EX質(zhì)譜儀測定DPP分子量。
　　2. ODN/DPP納米粒的制備與表征
　　將DPP與PS-ODN按不同氮磷比充分混勻，在37°C孵育，使DPP與PS-ODN通過靜電作用形成ODN/DPP納米粒。然后用凝膠電泳檢測，篩選出最佳N: P比，按最佳 N: P比制備納米粒并表征。表征主要分三部分，一是用透射電鏡觀察ODN/DPP納米粒的形態(tài)，二是用DLS測量納米粒粒徑和zeta電勢，三

9、是用熒光分光光度法定量ODN/DPP的包封率。
　　3. ODN/DPP納米粒形成的影響因素及穩(wěn)定性
　　用不同濃度的磷酸鹽緩沖液和不同pH值的磷酸鹽緩沖液為溶劑制備ODN/DPP納米粒，并比較不同條件下所制備的納米粒粒徑；用圓二色譜法測量不同溶劑中DPP的二級結(jié)構(gòu)，探索溶劑影響納米粒形成的原因；其次采用兩步法制備ODN/DPP/DOTAP納米粒，并通過DLS比較與ODN/DPP納米粒粒徑的大小，評價(jià)脂質(zhì)輔助劑 DOTAP對

10、納米粒粒徑的影響。將制備好的納米粒存儲于4°C，每隔一周用DLS測定其粒徑變化，連續(xù)測四周，以評價(jià)其時(shí)間穩(wěn)定性。
　　4. ODN/DPP納米粒對PS-ODN的遞送效率及特征
　　實(shí)驗(yàn)菌株選用產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌（ESBLs-EC）、敏感型大腸埃希菌（EC）、產(chǎn)超廣譜內(nèi)β-酰胺酶肺炎克雷伯桿菌（ESBLs-KP）、鼠傷寒沙門桿菌（ST）四株革蘭氏陰性菌，和金黃色葡萄球菌（SA）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）

11、、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（ MRSE）、糞腸球菌（ EF）四株革蘭氏陽性菌。用FITC-labeled PS-ODN與DPP制備納米粒，與細(xì)菌在37°C避光共孵育一定時(shí)間，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌陽性率，評價(jià)不同ODN/DPP納米粒在不同細(xì)菌內(nèi)的遞送能力和遞送速率。
　　5. ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP納米粒對細(xì)菌靶基因表達(dá)和細(xì)菌生長的抑制
　　實(shí)驗(yàn)菌株選用ESBLs-EC。采用RT-PCR法檢測anti-r

12、poD ODN/DPP和anti-rpoD ODN/DPP/DOTAP納米粒對ESBLs-EC靶基因rpoD表達(dá)的影響，通過生長曲線測定 ODN/DPP/DOTAP納米粒對細(xì)菌生長的抑制，確定 anti-rpoD ODN/DPP和anti-rpoD ODN/DPP/DOTAP納米粒能否將PS-ODN有效的遞送進(jìn)細(xì)菌內(nèi)并發(fā)揮抗菌作用。
　　6. ODN/DPP/DOTAP納米粒組分功能分析和納米粒的細(xì)菌攝取機(jī)制探討
　　制備

13、FITC-labeled ODN/DPP2納米粒、ODN/DPP2/DOTAP納米粒和ODN/DOTAP納米粒，并通過流式細(xì)胞儀分別檢測納米粒在 ESBLS-EC和 MRSA內(nèi)的遞送效率，結(jié)合RT-PCR和生長曲線的結(jié)果，分析納米粒中各組分的功能；將FITC-labeled ODN/DPP納米粒與細(xì)菌分別在4°C和37°C共孵育后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌陽性率，探索ODN/DPP納米粒的細(xì)菌內(nèi)遞送是否為能量依賴性過程；將細(xì)菌用哺乳細(xì)胞內(nèi)吞抑

14、制劑處理后，再與FITC-labeled ODN/DPP納米粒避光共孵育，并檢測細(xì)菌陽性率，以探索ODN/DPP納米粒的細(xì)菌內(nèi)攝取機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1. ODN/DPP納米粒制備及形態(tài)表征
　　通過凝膠電泳，得到ODN/DPP納米粒制備的最佳氮磷比為8；TEM觀察結(jié)果顯示氮磷比為8時(shí)，ODN/DPP納米粒呈球形，粒徑約45~80 nm；DLS測量結(jié)果顯示，ODN/DPP納米粒zeta電勢<5 mV，PDI<0.3

15、，分布均一；含有羥基氨基酸的DPP4和DPP5不能與PS-ODN形成穩(wěn)定納米粒；親水性與兩親性、電荷分布和組氨酸都對ODN/DPP納米粒形成沒有影響；ODN/DPP納米粒對PS-ODN的包封率在80％以上。
　　2. ODN/DPP納米粒粒徑的影響因素與穩(wěn)定性
　　溶劑中磷酸鹽濃度對ODN/DPP納米粒的制備具有顯著影響，溶劑中離子濃度的升高會導(dǎo)致納米粒粒徑急劇增大；除ODN/DPP2以外，溶劑pH值對的ODN/DPP納米粒

16、的形成過程沒有明顯影響；圓二色譜法分析結(jié)果顯示，當(dāng)鹽溶液濃度超過20 mM時(shí)，DPP的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化；在pH為5.5的酸性溶劑中，DPP2的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化。輔助劑DOTAP對納米粒粒徑?jīng)]有影響；穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，所制備的納米粒在4°C可穩(wěn)定保存2周。
　　3. ODN/DPP納米粒遞送效率及特征
　　與親水性DPP1，DPP4，DPP5和DPP6所制備的納米粒共孵育后，待測菌陽性率不足50%，而與兩親性DPP2，

17、DPP3和DPP7納米粒共孵育后，細(xì)菌陽性率多在90%以上；兩親性O(shè)DN/DPP納米粒在ESBLS-EC內(nèi)的遞送過程很快，孵育5至10 min細(xì)菌陽性率即達(dá)到最高，但在 MRSA菌株上，其遞送過程較慢，孵育30 min后才達(dá)到最高細(xì)菌陽性率。
　　4. ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP納米粒對靶基因表達(dá)和細(xì)菌生長的抑制
　　1μM的兩親性anti-rpoD ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP納米粒都能有效抑

18、制ESBLS-EC rpoD基因的表達(dá)，并能有效延遲細(xì)菌的生長，而且 ODN/DPP/DOTAP納米粒的效率更高。
　　5. ODN/DPP/DOTAP納米粒組分功能分析和納米粒的透膜機(jī)制探討
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，ODN/DPP2/DOTAP和ODN/DPP2納米粒的細(xì)菌內(nèi)遞送效率沒有顯著性差異，而ODN/DOTAP不能有效進(jìn)入菌內(nèi)，說明納米粒中DPP主要發(fā)揮透膜作用，而DOTAP并不影響透膜過程；細(xì)菌與ODN/DP

19、P納米粒在不同溫度孵育后，陽性率沒有顯著差別，提示ODN/DPP納米粒菌內(nèi)遞送過程是非能量依賴的；網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)胞吞抑制劑氯丙嗪能夠抑制ODN/DPP納米粒在革蘭氏陽性菌內(nèi)的遞送，而巨胞飲介導(dǎo)內(nèi)吞抑制劑阿米洛利和小窩蛋白介導(dǎo)胞吞抑制劑染料木素則無影響；三種胞吞抑制劑對ODN/DPP納米粒在革蘭氏陰性菌上內(nèi)的遞送效率無影響。
　　結(jié)論：
　　1.氮磷比為8時(shí)，可制備得到包封率高、穩(wěn)定性好，粒徑為45~80 nm的球形ODN/DP

20、P納米粒，其制備影響因素研究表明：溶劑鹽離子濃度能顯著增高納米粒粒徑，是影響ODN/DPP納米粒制備的關(guān)鍵因素。
　　2.兩親性DPP2，DPP3，DPP7制備的納米粒在實(shí)驗(yàn)所測八株菌中均有良好的遞送效率，在DOTAP存在條件下，能顯著抑制細(xì)菌靶基因的表達(dá)和延遲細(xì)菌的生長。
　　3.革蘭氏陰性菌和陽性菌對兩親性O(shè)DN/DPP納米粒存在不同的攝取機(jī)制。
　　4.證實(shí)脂質(zhì)DOTAP能顯著提高兩親性O(shè)DN/DPP納米對靶基因