母體甲基供體缺乏對子代小鼠實驗性結(jié)腸炎的影響及可能的表觀遺傳學(xué)機制研究.pdf

1、目的：
　　潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性、反復(fù)發(fā)作性的結(jié)直腸連續(xù)性黏膜炎癥性疾病，多以年輕患者多發(fā)。但其發(fā)病機制仍不明確。目前，認為UC是一種多因素、異質(zhì)性、多基因遺傳的疾病，多種因素包括環(huán)境、遺傳、感染、免疫、腸道微生物等相互作用的結(jié)果。近年來發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)是環(huán)境與遺傳因素之間的橋梁，其中DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，它能夠調(diào)節(jié)哺乳動物細胞的正常發(fā)育、分化，基因表達和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。D

2、NA甲基化需要甲基供體，包括葉酸、膽堿、B族維生素和甲硫氨酸。DNA高甲基化與基因沉默相關(guān)，而低甲基化則基因表達活躍。研究發(fā)現(xiàn)在UC患者腸道T淋巴細胞中，IFN-γ表達增加與甲基化水平降低相關(guān)，而且IFN-γ基因（IFNG）甲基化水平在調(diào)節(jié)黏膜細胞因子分泌中有重要作用。眾多證據(jù)表明在哺乳動物發(fā)育過程中，妊娠期和新生兒期的環(huán)境因素通過影響表觀遺傳修飾，導(dǎo)致表型的永久性改變。因此，改變母體飲食因素可能通過影響DNA甲基化參與UC發(fā)生、發(fā)展。

3、本研究以BALC/c鼠為研究對象，通過給予母鼠甲基供體缺乏飲食，構(gòu)建子代小鼠實驗性結(jié)腸炎模型，并檢測血清葉酸、維生素B12和同型半胱氨酸水平，結(jié)腸黏膜IFN-γ表達水平，以及IFNG啟動子區(qū)DNA甲基化水平，探討母體甲基供體缺乏是否通過影響DNA甲基化從而參與UC的發(fā)病過程。
　　方法：
　　1.動物模型建立：7周齡BALB/c雌鼠在孕前1個月開始分別喂養(yǎng)標準飲食（C， n=3）和甲基供體缺乏飲食（D，即無葉酸、膽堿、維生素

4、B12和甲硫氨酸， n=4），持續(xù)到子代斷乳（即出生后21天）；子代小鼠與母鼠相同飲食直到被處死。子鼠出生后第23天，造模組以2.5％葡聚糖硫酸鈉溶液（DSS）作為飲用水5天，飲食水量不限。子代小鼠分組如下：C/DSS-組、D/DSS-組、C/DSS+組、D/DSS+組，每組6只。
　　2.結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)（DAI）：每日觀察子代小鼠身體狀況、體質(zhì)量、糞便性狀、肛周紅腫糜爛和便血程度。根據(jù)體重減輕程度、糞便性狀和便血程度評分，分

5、數(shù)范圍0-4分，根據(jù)DAI=總分數(shù)/3（0-4），評估結(jié)腸炎癥程度。
　　3.采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測子代小鼠外周靜脈血清葉酸、維生素B12和同型半胱氨酸（Hcy）水平。
　　4.采用免疫組織化學(xué)SP法檢測子代小鼠結(jié)腸黏膜組織中IFN-γ的表達水平。
　　5.提取結(jié)腸組織樣本基因組 DNA，經(jīng)過亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，采用 Sequenom MassArray甲基化檢測方法檢測IFNG啟動子區(qū)CpG島甲基化水平。

6、r>　　結(jié)果：
　　1.甲基供體缺乏的證據(jù)：與標準飲食組（C/DSS-和C/DSS+組）相比，甲基供體缺乏飲食組（D/DSS-和D/DSS+組）小鼠的血清葉酸（8.87±1.11比11.34±0.31 nmol/L，P<0.01)、維生素B12（409.2±56.27比676.1±51.66 ng/L，P<0.01）水平均顯著降低；同型半胱氨酸（8.45±0.35比6.77±0.36μmol/L，P<0.01）水平顯著增高。

7、>　　2.甲基供體缺乏對DAI和組織學(xué)評分的影響：在DSS處理后第5天，結(jié)腸炎癥程度最高。C/DSS+組較C/DSS-組的DAI高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；D/DSS+組較C/DSS+組的DAI增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）,表明甲基供體缺乏飲食更加加重了小鼠結(jié)腸炎；C/DSS-組和D/DSS-組的DAI無統(tǒng)計學(xué)差異。D/DSS-組組織學(xué)評分高于C/DSS-組，D/DSS+組明顯高于C/DSS+組，也表明甲基供體缺乏飲

8、食加重了小鼠結(jié)腸炎。
　　3.小鼠結(jié)腸黏膜組織IFN-γ的表達水平：C/DSS+組和D/DSS+組IFN-γ表達水平較C/DSS-組和D/DSS-組顯著增高（2=14.875，P<0.01），而且D/DSS+組較C/DSS+組增高更明顯（P<0.01）。
　　4.小鼠結(jié)腸黏膜組織IFN-γ表達水平與DAI的相關(guān)性：C/DSS+組和D/DSS+組的IFN-γ表達水平與DAI呈正相關(guān)（r=0.853、0.840，P均<0.05）

9、。
　　5. IFNG啟動子區(qū)CpG島甲基化水平：對同一CpG位點四組樣本之間甲基化水平分析未發(fā)現(xiàn)明顯差異，對四組樣本之間所有CpG位點總甲基化水平分析也未發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.母體甲基供體缺乏能夠加劇子代小鼠實驗性結(jié)腸炎發(fā)病。
　　2.甲基供體缺乏飲食可以引起子代結(jié)腸黏膜IFN-γ表達增高，參與實驗性結(jié)腸炎發(fā)病。
　　3.甲基供體缺乏并非通過 IFNG啟動子區(qū) CpG島低甲基化，從而導(dǎo)致 I