葉酸缺乏與基因甲基化在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、目的:
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種特發(fā)性腸道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確?，F(xiàn)認(rèn)為是遺傳、感染、環(huán)境和免疫因素等多種因素相互作用的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)促炎因子干擾素γ在UC發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在UC結(jié)腸黏膜中其表達(dá)水平明顯增多，而且干擾素基因啟動(dòng)子區(qū)存在低甲基化改變，其高表達(dá)很可能是基因低甲基化的結(jié)果。另外有研究表明，在UC小鼠模型中，給予甲基供體(葉酸、維生素B12)缺乏食物可促

2、使某些細(xì)胞炎癥因子及化學(xué)因子的表達(dá)增多，進(jìn)一步加重結(jié)腸黏膜炎癥程度。本研究通過給予UC小鼠模型葉酸缺乏食物，并檢測(cè)血清葉酸，結(jié)腸黏膜干擾素γ的表達(dá)水平及干擾素基因甲基化水平，分析葉酸缺乏是否通過導(dǎo)致基因低甲基化，使干擾素γ高表達(dá)而在UC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，為UC的診斷及治療提供新的依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1動(dòng)物模型的建立及分組:選取符合實(shí)驗(yàn)要求的雌性BALB/C小鼠24只，并隨機(jī)分為4組，每組6只，分組如下:A組葉酸缺

3、乏(D)，造模(DSS+);B組標(biāo)準(zhǔn)飲食(C)，造模(DSS+);C組標(biāo)準(zhǔn)飲食(C)，未造模(DSS-);D組葉酸缺乏(D)，未造模(DSS-)。D:予以無葉酸飲食飼養(yǎng);C:給予等量標(biāo)準(zhǔn)飲食，飲水量不限;DSS+:自第6周起，給予5％葡聚糖硫酸鈉溶液作為飲用水，持續(xù)7天，擬建立急性結(jié)腸炎小鼠模型:DSS-:僅飲用純凈水，作為對(duì)照。
　　2一般狀況觀察:分別于實(shí)驗(yàn)開始前，第5、6周末記錄小鼠體重變化;每日觀察小鼠飲食、飲水量，活動(dòng)狀

4、態(tài)等生命體征情況;自第6周起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日觀察并記錄小鼠糞便性狀、肛周紅腫、糜爛及便血程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別采集4組小鼠尾靜脈血及新鮮結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本。
　　3結(jié)腸炎癥活動(dòng)度評(píng)價(jià):根據(jù)小鼠體重減輕程度、糞便性狀、便血程度計(jì)分，“正?！庇?jì)為0分，其余根據(jù)程度不同分別計(jì)為1、2、3、4分，記錄總分?jǐn)?shù)，依據(jù)“結(jié)腸炎癥活動(dòng)指數(shù)”=總分?jǐn)?shù)/3(0-4)，評(píng)估結(jié)腸炎癥活動(dòng)度;0為健康，4表示炎癥活動(dòng)程度最大。
　　4血清葉酸檢測(cè):采用

5、生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠外周靜脈血清葉酸水平。
　　5干擾素γ的表達(dá):利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜組織干擾素γ的表達(dá)。
　　6干擾素基因甲基化:應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行干擾素基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島預(yù)測(cè)并設(shè)計(jì)甲基化特異性PCR引物。提取結(jié)腸組織DNA，應(yīng)用MSP檢測(cè)干擾素基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平。
　　結(jié)果:
　　1外周靜脈血清葉酸水平
　　分別檢測(cè)四組小鼠血清葉酸濃度

6、，單位為ng/ml，A組濃度值范圍在2.5～3.0，平均值為2.75;B組范圍在13.2～14.1，平均值為13.6;C組范圍在12.5～14.5，平均值為13.5，;D組范圍在2.4～3.1，平均值為2.8。A組和D組的血清葉酸水平較B組和C組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組與C組之間，A組與D組之間相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，P值分別為0.62和0.25。
　　2結(jié)腸黏膜組織干擾素γ表達(dá)水平

7、>　　A組和B組結(jié)腸黏膜組織干擾素γ表達(dá)水平較C組和D組均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);A組較B組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);C組與D組之間相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3干擾素γ表達(dá)水平與結(jié)腸炎癥活動(dòng)性指數(shù)的相關(guān)性分析
　　A組和B組中，干擾素γ表達(dá)水平與結(jié)腸炎癥活動(dòng)性指數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.796(P＜0.01)。
　　4葉酸水平分別與干擾素γ表達(dá)水平、結(jié)腸炎癥

8、活動(dòng)性指數(shù)的相關(guān)性分析
　　A組中，葉酸水平分別與干擾素γ表達(dá)水平、結(jié)腸炎癥活動(dòng)性指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.880、-0.997(P＜0.05);B組中，葉酸水平與干擾素γ的表達(dá)、結(jié)腸炎癥活動(dòng)性指數(shù)不具有相關(guān)性(P＞0.05);C組中，葉酸水平與干擾素γ表達(dá)水平無相關(guān)性(P＞0.05);D組中，葉酸水平與干擾素γ水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.867(P＜0.05)。
　　5各組小鼠結(jié)腸黏膜組織干擾素基因MSP檢測(cè)

9、，未出現(xiàn)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化
　　MSP產(chǎn)物經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)IFNG的甲基化改變，A、B、C、D四組樣本分別用甲基化特異性引物擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)未出現(xiàn)甲基化條帶;四組樣本用非甲基化特異性引物擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)出現(xiàn)非甲基化條帶，基因擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約70bp(50bp～100bp);空白對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。
　　結(jié)論:
　　1在急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中，葉酸的缺乏可導(dǎo)致炎癥因子干擾素γ的表達(dá)增高，加重結(jié)