豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF3、ORF4、ORF5編碼產(chǎn)物的體外表達(dá).pdf

1、PCV-2屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae),可引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS),給世界養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失.到目前為止,對該病的致病機(jī)理還不完全清楚.PCV-2有11個(gè)閱讀框,目前已知ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白,而ORF2則因其編碼的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性而成為一個(gè)研究熱點(diǎn),但針對其他閱讀框的研究卻很少.本研究通過PCR擴(kuò)增,以PCV-2-HZ0201為模板成功克隆了PCV-2-ORF3,ORF4基

2、因,以PCV-2美國株為模板克隆了ORF5基因,并成功構(gòu)建了ORF3,ORF4,ORF5基因的原核表達(dá)載體,得到了ORF3,ORF4的純化蛋白,并利用綠色熒光蛋白(EGFP)對上述三種基因編碼的重組蛋白進(jìn)行了真核PK-15細(xì)胞定位觀察,為進(jìn)一步研究這些蛋白打下了基礎(chǔ).具體結(jié)果如下:1.根據(jù)PCV-2核酸序列設(shè)計(jì)合成特異性引物,采用融合PCR技術(shù)對影響PCV-2ORF3在E.coli中表達(dá)的稀有密碼子進(jìn)行改造,構(gòu)建了pGEX-4T-1-O

3、RF3表達(dá)載體,同時(shí)我們也構(gòu)建了PCV-2 ORF4、ORF5基因的原核表達(dá)系統(tǒng).2.SDS-PAGE電泳和Western blot分析表明,PCV-2 ORF3、ORF4和ORF5基因編碼產(chǎn)物在E.coli中成功表達(dá),并可被抗GST多抗特異識(shí)別,其分子量分別為37.7、32.5和35kDa.同時(shí),改造后的ORF3基因成功表達(dá)也證明稀有密碼子是影響外源基因在E.coli中表達(dá)的重要因素.3.重組蛋白PCV-2 ORF3和ORF4經(jīng)超聲波

4、裂解后SDS-PAGE電泳分析,這兩種重組蛋白在E.coli中以包涵體形式存在,包涵體蛋白雖經(jīng)溶解變性及復(fù)性處理,用Hitrap親和柱純化蛋白仍沒有得到純化蛋白,說明PCV-2 ORF3、ORF4的編碼蛋白與GST融合后可能改變了原有GST蛋白的空間構(gòu)象,影響與親和瓊脂糖凝膠的結(jié)合.我們用割膠法純化重組PCV-2 ORF3和ORF4蛋白用于制備其單克隆抗體.4.為研究PCV-2 ORF3,ORF4,ORF5基因編碼產(chǎn)物在真核PK-15細(xì)