TL1A對慢性實驗性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織Th9細胞活化的影響.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)是炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)的一種，其發(fā)病機制尚不明了。目前認為腸黏膜免疫異常、持續(xù)腸道感染、遺傳和環(huán)境等因素均參與了該病的發(fā)生發(fā)展，其中免疫調(diào)控失衡是UC的重要致病因素。CD4+T細胞是免疫系統(tǒng)中最重要的效能細胞，包括輔助性T細胞(Thelpercell，Thcell)和調(diào)節(jié)性T細胞(TregulatoryTcell，Treg)，在調(diào)控

2、體內(nèi)免疫應(yīng)答和維持免疫平衡中發(fā)揮重要作用。CD4+T細胞過度增殖、分化導(dǎo)致促炎與抗炎免疫失衡是UC的主要特點之一。
　　近年來的研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)和白細胞介素(interleukin，IL)-4聯(lián)合可誘導(dǎo)CD4+初始T細胞分化成一群大量分泌IL-9的新T細胞亞群，活化的Th2細胞在TGF-β單獨存在的情況下也可以產(chǎn)生相同的結(jié)果。因其主要分泌細胞因子IL-9，

3、且誘導(dǎo)分化途徑又不同于T細胞的其他亞群，所以被命名為Th9(CD4+IL-9+)細胞。Th9細胞參與了自身免疫性腦脊髓膜炎、結(jié)核性胸膜炎、過敏性皮炎等多種炎性疾病的炎癥進展，給重組活化基因1缺陷(recombination-activatinggene1-deficient，RAG-1)小鼠回輸Th9細胞亦可成功誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A(tumornecrosisfactor-likeligand1aberr

4、ance，TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(TNFsuperfamilymember15，TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物，主要表達在人類的內(nèi)皮細胞，包括人臍靜脈內(nèi)皮細胞、成人皮膚微血管內(nèi)皮細胞和子宮肌層內(nèi)皮細胞等。目前研究表明，TL1A是IBD的易感基因，可通過與死亡受體3(deathreceptor，DR3)結(jié)合，激活Th1、Th2和Th17細胞，致腸黏膜免疫紊亂，引發(fā)IBD的腸道炎癥反應(yīng)。然而目前TL1A對Th9細胞的影響尚不

5、清楚。本研究主要是通過檢測TL1A轉(zhuǎn)基因小鼠及WT小鼠結(jié)腸組織中Th9細胞水平探討TL1A對Th9細胞活化的影響。
　　目的:探討TL1A對慢性實驗性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中Th9細胞活化的影響。
　　方法:①本實驗以淋巴細胞過表達TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠及WT小鼠為研究對象，采用RT-PCR方法進行TL1A的轉(zhuǎn)基因(LCK-CD2-TL1A-GFP，L-Tg)小鼠的鑒定與篩選;②12只具有相同遺傳背景的C57BL/6WT小鼠（體重

6、15～18g，6～8周齡）隨機分為Control/WT組、DSS/WT組，每組6只;12只L-Tg小鼠（體重15～18g，6～8周齡）隨機分為Control/Tg組、DSS/Tg組，每組6只。Control組飲用蒸餾水，DSS組間斷飲用3％右旋葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesodium，DSS)，時間段分別為第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天及第27、28天，其余時間飲用蒸餾水，第29天處死動物;③每日

7、觀察小鼠的精神狀態(tài)、體重、活動情況、毛發(fā)光澤度、糞便形狀、大便潛血情況等，進行疾病活動指數(shù)(diseaseactivityindex，DAI)評分，評估結(jié)腸炎癥程度;④觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變，記錄結(jié)腸長度變化，進行大體評分;⑤應(yīng)用蘇木素伊紅(Hematoxylinandeosin，H&E)染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變并評分;⑥測定結(jié)腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)含量;⑦分離腸黏膜固有層單個核細胞(laminapr

8、opriamononuclearcells，LPMC)并計數(shù)，應(yīng)用流式細胞術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)C)檢測Th9(CD4+IL9+T)細胞占CD4+T細胞比例。
　　結(jié)果:①體重改變:Control/WT組與Control/Tg組小鼠體重增加，分別為42.06％±6.41％和35.26％±2.70％;DSS/WT組小鼠體重雖亦有增加，但增加幅度顯著低于Control/WT組(9.28％±5.70％vs42.06％±6.4

9、1％，P＜0.05);DSS/Tg組小鼠體重較原始體重降低，顯著低于Control/Tg組(-9.66％±2.50％vs35.26％±1.56％，P＜0.05)，并且顯著低于DSS/WT組(-9.66％±2.50％vs9.28％±5.70％，P＜0.05)。②DAI評分:Control/WT組和Control/Tg組小鼠DAI評分均為(0.00±0.00)，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異;DSS/WT組與DSS/Tg組小鼠的DAI評分逐漸升高，且

10、DSS/Tg組顯著高于DSS/WT組(2.55±0.90vs1.58±0.70，P＜0.05)。③結(jié)腸長度、大體形態(tài)學(xué)及病理學(xué)評分:Control/WT組與Control/Tg組結(jié)腸形態(tài)正常，H&E染色未見粘膜破損、炎癥細胞浸潤及潰瘍形成，而DSS/WT組與Control/WT組相比，結(jié)腸長度顯著縮短(6.38±0.47vs7.63±0.54，P＜0.05)，形態(tài)學(xué)評分顯著增高(1.60±0.31vs0.00±0.00，P＜0.05)，

11、病理見黏膜上皮缺損、大量炎癥細胞浸潤、淺潰瘍生成，病理評分也顯著高于Control/WT組(9.50±0.79vs0.00±0.00，P＜0.05);DSS/Tg組小鼠的結(jié)腸長度顯著短于DSS/WT組(5.30±0.18vs6.38±0.47，P＜0.05)，結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分及病理評分也顯著高于DSS/WT組，分別為(2.80±0.64vs1.60±0.31，P＜0.05)和(11.85±0.86vs9.50±0.79，P＜0.05)。④

12、MPO活性檢測:DSS/WT組的MPO活性顯著高于Control/WT組(1.48±0.40vs0.65±0.26，P＜0.05);DSS/Tg組的MPO活性顯著高于Control/Tg組(2.20±0.45vs0.93±0.25U/g，P＜0.05);DSS/Tg組高于DSS/WT組(2.20±0.45vs1.48±0.40，P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。⑤分離、計數(shù)LPMC，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測LPMC中Th9細胞占CD4+T細胞

13、比例:DSS/WT組的LPMC數(shù)顯著高于Control/WT組(2.65×106±0.32×106vs1.68×106±0.15×106，P＜0.05);DSS/Tg組的LPMC數(shù)顯著高于Control/Tg組(3.70×106±0.28×106vs1.72×106±0.17×106,P＜0.05)和DSS/WT組(3.70×106±0.28×106vs2.65×106±0.32×106，P＜0.05)。結(jié)腸組織LPMC中Th9細胞占C

14、D4+T細胞比例:Control/WT組為0.10％±0.02％，Control/Tg組為0.12％±0.01％。DSS/WT組顯著高于Control/WT組(0.23％±0.03％vs0.10％±0.02％，P＜0.05);DSS/Tg組顯著高于Control/Tg組(0.54％±0.04％vs0.12％±0.01％,P＜0.05)和DSS/WT組(0.54％±0.04％vs0.23％±0.03％,P＜0.05)。
　　結(jié)論:T