淋系細(xì)胞高表達(dá)TL1A對DSS誘導(dǎo)的慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的影響.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括克羅恩病(Crohn's disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)，是一種病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚的非特異性腸道疾病，具有慢性及反復(fù)發(fā)作的特點。腸纖維化是 IBD較嚴(yán)重的并發(fā)癥，被認(rèn)為是腸道組織對于慢性炎癥和損傷過度的、不可逆的傷口愈合反應(yīng)。有數(shù)據(jù)表明，40％以上的CD有程度不等的腸梗阻，約80%的患者最終

2、需要手術(shù)治療。可見，腸纖維化已成為臨床IBD治療中面臨的重要問題。
　　CD4+T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中最重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在調(diào)控體內(nèi)免疫應(yīng)答和維持免疫平衡穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。其輔助性T細(xì)胞(T helper cell, Th)又包含Th1、Th2及Th17三種細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等促炎介質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)；而Th17細(xì)胞主要分泌IL-17和IL-6等細(xì)胞因子。目前傾向于Th1和Th17細(xì)胞主

3、要參與CD發(fā)生。
　　腸纖維化的發(fā)生是一種復(fù)雜、動態(tài)的病理生理過程，目前認(rèn)為是在易感基因基礎(chǔ)上，出現(xiàn)腸黏膜免疫失調(diào)，與腸菌抗原相互作用，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞浸潤，釋放的炎癥因子和生長因子等激活腸道間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生膠原等細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分沉積于腸壁所致[1]。在腸道纖維化過程中主要的效應(yīng)細(xì)胞是腸道成纖維細(xì)胞(intestinal fibroblasts, IFBs)，當(dāng)該細(xì)胞增殖及活化增強(qiáng)時

4、，其增殖與活化的標(biāo)志物Vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)。IFBs的合成與分泌ECM的功能增強(qiáng)，一般情況下，成纖維細(xì)胞不表達(dá)α-SMA蛋白，但在各種因素如細(xì)胞因子和炎癥因子等的刺激下將發(fā)生活化，其α-SMA與膠原合成的功能均增強(qiáng)。TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)對于腸成纖維細(xì)胞活化以及其所產(chǎn)生的效應(yīng)改變發(fā)揮著不可忽視的作用。研究顯示，腸道炎癥發(fā)生過程中I型膠原、III型膠原沉積和TGF-β1表達(dá)增加的同時，磷酸化Smad3表達(dá)也增加。<

5、br>　　腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule1A, TL1A)在炎癥組織巨噬細(xì)胞、黏膜固有層T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC中均有表達(dá)。TL1A作為TNF的唯一配體，可通過與其受體腫瘤壞死因子受體超家族成員死亡受體3(death receptor3, DR3)結(jié)合，為T淋巴細(xì)胞的激活提供協(xié)同刺激信號，促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的極化及效應(yīng)功能，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重

6、要作用。TL1A可通過與IL-12/IL-18結(jié)合而增強(qiáng)IFN-γ的誘導(dǎo)表達(dá)，其持續(xù)表達(dá)可促進(jìn)黏膜的炎性反應(yīng)和腸壁纖維化的發(fā)生、誘導(dǎo)纖維性狹窄的發(fā)生。TL1A不僅可單獨(dú)或協(xié)同IL-12和IL-23作用于Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，同時還可作用于Th17細(xì)胞使其分泌IL-17增加。
　　TL1A是IBD的易感基因之一，TL1A及其受體可通過影響腸黏膜T細(xì)胞的活化、增殖，誘導(dǎo)Th細(xì)胞極化，從而致腸黏膜免疫系統(tǒng)耐受機(jī)制紊亂，由此引發(fā)腸道炎

7、癥反應(yīng)，從而參與IBD的發(fā)生。而慢性炎癥反應(yīng)是腸纖維化發(fā)生的首發(fā)因素，炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步激活腸成纖維細(xì)胞的活化，產(chǎn)生大量ECM，以致腸纖維化的形成。
　　目的：探討淋巴細(xì)胞高表達(dá)TL1A在DSS誘導(dǎo)的慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化中的作用，旨在為臨床IBD及腸纖維化的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1 LCK-CD2-TL1A-GFP基因型的小鼠采用real-time Q-PCR的方法進(jìn)行篩選與鑒定。
　　2右旋

8、葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)建立小鼠腸纖維化的模型，將轉(zhuǎn)基因型小鼠與C57BL/6野生型小鼠（體重20~25g，8~12周）分別隨機(jī)分為Control、DSS組，每組6只小鼠。Control組給予飲用蒸餾水，DSS組給予間斷飲用2%DSS水，共四周。飲用DSS的時間段為：第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天，第27、28天及其余時間飲用蒸餾水。
　　3每日觀察小鼠的

9、食欲、體重、糞便性狀、活動情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、大便隱血（聯(lián)苯胺法測定）及便血情況等，參照 Cooper HS評分系統(tǒng)進(jìn)行疾病活動指數(shù)（disease activity index, DAI）評分，評估腸黏膜的炎癥程度。
　　4觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)的變化，測量結(jié)腸的長度，計算結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分、組織病理學(xué)評分以及測定結(jié)腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)含量，評估結(jié)腸炎癥程度。
　　5免疫熒光技術(shù)，檢測

10、CD4+T淋巴細(xì)胞、IFN-γ、IL-17在小鼠腸組織中的定位表達(dá)，評估在慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化過程中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)量的變化。
　　6提取脾臟、腸系膜淋巴結(jié)中(mesenteric lymph nodes, MLN)的單個核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)量，探討在慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化過程中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)量的

11、變化。
　　7酶聯(lián)吸附反應(yīng)試驗(enzyme-linked immune sorbent assay, ELISA)檢測IFN-γ、IL-17，評估在慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化過程中組織細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。
　　8 Masson染色與天狼猩紅染色方法，檢測結(jié)腸組織中膠原纖維的厚度，評估結(jié)腸纖維化的程度。
　　9免疫組織化學(xué)檢測I型膠原、III型膠原、Vimentin、α-smooth muscle actin

12、(α-SMA)、以及TGF-β1/Smad3在小鼠結(jié)腸組織中的的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1根據(jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP的序列，測定小鼠的DNA，在192 bp的位置是轉(zhuǎn)基因小鼠的目的基因測定成像，而野生型小鼠基因測定成像，沒有檢測到該目的基因，根據(jù)此結(jié)果篩選并鑒定轉(zhuǎn)基因的小鼠.
　　2與Control組小鼠相比，野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠DSS組的體重逐漸減輕，DAI評分逐漸升高，結(jié)腸壁明顯充血水腫，結(jié)腸長度縮短

13、；結(jié)腸組織病理結(jié)果顯示：可見淺潰瘍形成，炎癥細(xì)胞浸潤，病理評分升高(WT小鼠：11.75±0.50 vs00.00±0.00, P<0.05；Tg小鼠：14.00±1.05 vs0.00±0.00, P<0.05)；MPO活性明顯升高(P<0.05)。DSS組小鼠中，與WT小鼠相比較，Tg小鼠的DSS組結(jié)腸炎癥程度增加(P<0.05).
　　3免疫熒光檢測IL-17、IFN-γ表達(dá)情況，DSS組小鼠中Tg小鼠與WT小鼠相比較，Tg

14、小鼠IL-17的平均光密度顯著升高(126.426 U/g±15.939 U/g vs84.528 U/g±11.967 U/g, P<0.05)。DSS組小鼠中，與WT小鼠相比較， Tg小鼠 IFN-γ的平均光密度顯著升高(115.428 U/g±13.933 U/g vs81.978 U/g±11.967 U/g, P<0.05)。
　　4流式細(xì)胞術(shù)檢測MLN、脾臟單個核淋巴細(xì)胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+細(xì)胞

15、數(shù)量，在DSS組中，Tg小鼠與WT小鼠相比較，MLN單個核淋巴細(xì)胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)的百分比明顯升高(CD4+IFN-γ+:8.04%±0.44% vs6.71%±0.26%, P<0.05; CD4+IL-17+:5.61%±0.19%vs2.47%±0.28%, P<0.05)；在DSS組中，Tg小鼠與WT小鼠相比較，脾臟單個核淋巴細(xì)胞中的CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)的百分比明顯升

16、高(CD4+IFN-γ+:10.45%±0.66% vs7.29%±0.58%, P<0.05;CD4+IL-17+:3.33%±0.33%vs2.10%±0.36%, P<0.05)。
　　5 ELISA檢測脾臟、LPMC、MLN的單個核細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-17的水平，結(jié)果顯示：與Control組相比，DSS組中WT與Tg小鼠小鼠脾臟、LPMC、MLN中單個核淋巴細(xì)胞上清液中的IFN-γ、IL-17水平升高， WT小鼠

17、(LPMC分泌的IFN-γ水平：1,277.484±9.211 pg/mL vs56.994±4.960 pg/mL, P<0.05；LPMC分泌的IL-17水平：31.628±1.055 pg/mL vs30.800±5.714 pg/mL, P<0.05)；Tg小鼠(LPMC分泌的IFN-γ水平：1,382.315±152.343 pg/mL vs120.444±35.144 pg/mL, P<0.05；LPMC分泌的IL-17水平

18、：36.143±8.630 pg/mL vs35.744±1.446 pg/mL, P<0.05)；DSS組中Tg小鼠與WT小鼠相比，脾臟、LPMC、MLN中單個核淋巴細(xì)胞上清液中的IFN-γ、IL-17水平明顯升高(LPMC分泌的IFN-γ水平：1,382.315±152.343 pg/mL vs1,277.484±9.211 pg/mL, P<0.05；LPMC分泌的IL-17水平：36.143±8.630 pg/mL vs31.6

19、28±1.055 pg/mL, P<0.05)。
　　6 Masson染色與天狼猩紅染色觀察膠原纖維染色程度，在DSS組中，與WT小鼠相比，Tg小鼠的Masson染色與天狼猩紅染色腸纖維化程度明顯加重(0.47±0.05 vs0.36±0.016, P<0.05;0.40±0.01 vs0.32±0.015, P<0.05)。
　　7在DSS組中，與WT小鼠相比，Tg小鼠免疫組織化學(xué)染色檢測Vimentin(0.80±0.0

20、2 vs0.65±0.05, P<0.05)、α-smooth muscle actin(α-SMA)(0.60±0.04 vs0.39±0.04, P<0.05)、I型膠原(0.67±0.08 vs0.39±0.01, P<0.05)、III型膠原(0.83±0.04 vs0.49±0.03, P<0.05)、以及 TGF-β1(0.73±0.04 vs0.55±0.04, P<0.05)/Smad3(0.83±0.04 vs0.59