Th17細胞在TL1A調(diào)控結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中作用的初步研究.pdf

1、隨著我國炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease， IBD）發(fā)病率的不斷攀升，對其機制及并發(fā)癥防治的研究也正日益成為人們關(guān)注的焦點。這其中結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(colitis associated colorectal cancer，CAC)是一種與IBD密切相關(guān)，最令人擔憂的遠期并發(fā)癥，其發(fā)生與病變范圍、炎癥程度、發(fā)病年齡、患病時間和結(jié)直腸癌家族史等因素有關(guān)。研究其發(fā)病機制能為臨床上有效防治結(jié)直腸癌提供有力幫助。

2、
　　CAC是腸道在反復的炎癥刺激基礎(chǔ)上，不斷地增生修復最終由不典型增生轉(zhuǎn)變?yōu)榘┑臐u進過程。這其中炎癥是其始動因素。作為體內(nèi)重要促炎因子的白細胞介素17(Interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)，除了參與多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生外還對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。在圍繞結(jié)腸炎誘發(fā)癌變分子激

3、活的機制研究中發(fā)現(xiàn):細胞因子可以通過與特異性受體結(jié)合，增強包括NF-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、WNT、STAT3等在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性，從而發(fā)揮對CAC的調(diào)控作用。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A(TNF-like ligand1 aberrance，TL1A)是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子超家族成員，體內(nèi)、體外的研究均已證實TL1A可以通過促進T細胞和APCs的表型活化，增強單個核細胞分泌Th17型

4、細胞因子活性，上調(diào)IL-17、TNF-α和IL-6的表達，促進腸黏膜炎癥的發(fā)生，參與IBD的起病。那么它作為T細胞的免疫增強子是否會通過促進炎癥反應而影響CAC的發(fā)生呢？目前尚未有相關(guān)文獻報道，為此我們利用TL1A過表達的轉(zhuǎn)基因(LCK-CD2-TL1A-GFP-transgenic，L-Tg)小鼠和野生型(wild type，WT)C57BL/6小鼠，建立實驗性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型，研究TL1A在其中的作用以期尋找問題的答案。

5、>　　目的:建立炎癥誘導的小鼠結(jié)直腸癌模型，了解TL1A在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中的作用。
　　方法:①采用real-time Q-PCR方法進行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鑒定與篩選。②通過誘變劑AOM與致炎劑DSS聯(lián)合誘導的方式建立實驗性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型，將L-Tg小鼠與C57BL/6 WT小鼠(8-12周)分別隨機分為Control組、AOM組、DSS組和AOM+DSS組，共8組，每組10只。Control

6、組正常飲食;AOM組在實驗第一天接受10mg/Kg AOM單劑量腹腔注射后正常飲食;DSS組先連續(xù)飲用7天濃度為2.5％的DSS，隨后14天飲用蒸餾水，以此為一個循環(huán)，共飲用4個循環(huán);AOM+DSS組單劑量腹腔注射AOM10 mg/Kg聯(lián)合間斷飲用4個循環(huán)的2.5％DSS。③結(jié)腸黏膜炎癥程度的評估包括體重變化(Body weight，BW)、疾病活動指數(shù)(Disease activity index，DAI)、結(jié)腸形態(tài)學變化、組織病理學

7、評分和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測。④腫瘤形成情況的評估包括計算腫瘤的數(shù)目、直徑、成瘤率并對異型增生程度進行組織病理學評估。⑤應用Western blot技術(shù)檢測結(jié)腸組織中IL-17A、TNF-α和IL-6蛋白的定量表達。⑥將MPO活性和IL-17A、TNF-α、IL-6的相對表達量分別與腫瘤的數(shù)目、大小和異型增生評分做相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:①根據(jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列測定小鼠DN

8、A，Tg小鼠目的基因成像在192 bp位置，而WT小鼠基因測定成像，在192 bp位置未檢測到目的基因，據(jù)此篩選鑒定Tg小鼠;②與Control組和AOM組相比，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的DSS組和AOM+DSS組小鼠體重均有減輕，DAI評分顯著升高，AOM+DSS/Tg組比AOM+DSS/WT組升高更明顯(2.3±0.76 vs1.28±0.47，P＜0.05);大體形態(tài)顯示:DSS組結(jié)腸腸壁充血、水腫，AOM+DSS組腸壁增厚并出現(xiàn)腸

9、腔狹窄、扭曲;光鏡下可見DSS組結(jié)腸組織有大量炎癥細胞浸潤，黏膜上皮破壞形成淺潰瘍，病理評分顯著增加，AOM+DSS組可見腺體扭曲變形，細胞大小不等，形態(tài)不一，核大深染，呈異型性增生。MPO結(jié)果顯示:WT和Tg小鼠的Control組和AOM組間MPO活性均無明顯差異，而與Control組和AOM組相比，DSS組、AOM+DSS組小鼠結(jié)腸MPO明顯升高，DSS/Tg、 AOM+DSS/Tg較DSS/WT、AOM+DSS/WT組升高更明顯;

10、③計算腫瘤的數(shù)目、大小和成瘤率，與野生型鼠比較，AOM+DSS/Tg組瘤體數(shù)目增多（5.62±1.30 vs3.5±1.19，P＜0.05）、直徑增大（2.98±0.79 vs2.08±0.37，P＜0.05），成瘤率明顯增高(88.9％ vs66.7％)且異型增生的組織病理學評分明顯增高（2.75±0.5 vs1.7±0.8，P＜0.05）;④用Western blot檢測IL-17A、TNF-α和IL-6表達，結(jié)果顯示:與Contr

11、ol組和AOM組相比，WT和Tg小鼠的DSS組、AOM+DSS組IL-17A、TNF-α和IL-6表達水平顯著升高(P＜0.05），AOM+DSS/Tg組比AOM+DSS/WT升高明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）⑤MPO活性與腫瘤的數(shù)目、大小呈正相關(guān)(r=0.6，r=0.55，P＜0.05); IL-17A、TNF-α、IL-6的相對表達量均與腫瘤的數(shù)目和異型增生評分呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），IL-17A、TNF-α同時還