新型MyD88抑制劑作用機(jī)制及其在防治結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、第一部分新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5抑制MyD88二聚化的作用及機(jī)制探討
　　目的：探討新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5抑制MyD88同源二聚化和異源二聚化的作用并闡明其機(jī)理，為計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：體外構(gòu)建Flag-MyD88 pcDNA3.1-，HA-MyD88 pcDNA3.1-和 Flag-TIRAP pcDNA3.1-質(zhì)粒，采用免疫共沉淀方法，將 Flag-MyD88 pc

2、DNA3.1-和 HA-MyD88 pcDNA3.1-共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞，以及 Flag-TIRAP pcDNA3.1-和 HA-MyD88 pcDNA3.1-共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并給與不同濃度TJ-M2010-5干預(yù)（0μM，10μM，40μM），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測MyD88-MyD88以及TIRAP-MyD88的結(jié)合能力。體外誘導(dǎo)培養(yǎng) BALB/c小鼠不成熟骨髓源性樹突狀細(xì)胞，培養(yǎng)第7天給予不同濃度TJ-M2010-5

3、干預(yù)（0μM，10μM，40μM）2小時(shí)后，給予LPS刺激活化TLR信號(hào)通路，48小時(shí)后，通過EMSA方法檢測細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的含量，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β表達(dá)水平。
　　結(jié)果：TJ-M2010-5劑量依賴性的抑制MyD88-MyD88和TIRAP-MyD88結(jié)合能力，隨著劑量增加，抑制作用加強(qiáng)。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)BALB/c小鼠，給予不同濃度TJ-M2010-5干預(yù)和LPS刺激后，TJ-M20

4、10-5抑制NF-κB入核，以及TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，并且隨著TJ-M2010-5濃度增加，抑制作用逐漸加強(qiáng)。
　　結(jié)論：TJ-M2010-5通過干擾MyD88-MyD88同源二聚化和TIRAP-MyD88異源二聚化從而發(fā)揮了抑制MyD88二聚化的作用，同時(shí)，TJ-M2010-5進(jìn)一步抑制了TLR/MyD88信號(hào)通路的活化。因此，TJ-M2010-5可以作為一種有效的MyD88抑制劑干預(yù)依賴MyD88的TLR信號(hào)通路，

5、為將來應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。
　　第二部分新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5防治結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的作用及機(jī)制探討
　　目的：探討新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5在防治AOM/DSS誘發(fā)小鼠CAC中的作用及機(jī)制，為TJ-M2010-5進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：通過聯(lián)合使用AOM和DSS誘導(dǎo)小鼠CAC模型，并給予TJ-M2010-5干預(yù)。小鼠腹腔注射大劑量TJ-M2010-5后，通過觀察小

6、鼠活動(dòng)度等指標(biāo)以評估藥物急性毒性；小鼠腹腔注射常規(guī)劑量 TJ-M2010-5后，通過檢測小鼠血常規(guī)指標(biāo)，肝臟、腎臟 HE染色以評估藥物亞急性毒性。實(shí)驗(yàn)分為三組：Normal組，AOM/DSS組，TJ-M2010-5組。觀察10周，記錄建模后小鼠體重變化，生存率差異。體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，TJ-M2010-5干預(yù)后給予LPS刺激，檢測細(xì)胞內(nèi)IRAK4、p38、Erk磷酸化水平，同時(shí)，通過EMSA方法檢測結(jié)腸組織中NF-κB入核能力

7、，以評估TJ-M2010-5對CAC小鼠TLR/MyD88信號(hào)通路的影響。大體觀察小鼠結(jié)腸腫瘤形成情況并通過HE染色分析腫瘤惡性程度，COX2免疫組織化學(xué)染色和Western blot分析評價(jià)腫瘤進(jìn)展情況。結(jié)腸HE染色檢查評估炎癥反應(yīng)程度，MPO免疫組織化學(xué)染色檢測中性粒細(xì)胞浸潤情況。BrdU摻入法和Ki-67染色檢查結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖狀況，活性caspase-3染色和TUNEL染色檢查結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡狀況。Bio-Plex和ELISA方

8、法分析CAC小鼠血清細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平，qPCR方法分析結(jié)腸細(xì)胞因子mRNA水平。免疫組織化學(xué)染色方法檢測結(jié)腸CD68+巨噬細(xì)胞浸潤情況，流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)腸LPMC中巨噬細(xì)胞、DC、CD4+T細(xì)胞比例，qPCR方法分析LPMC中巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA水平。
　　結(jié)果：聯(lián)合使用 AOM和 DSS成功誘發(fā)了小鼠 CAC模型。藥物安全性評估顯示TJ-M2010-5不會(huì)對小鼠產(chǎn)生急性和亞急性毒性作用。TJ-M2010-5抑制了 C

9、AC小鼠TLR/MyD88信號(hào)通路活性。與AOM/DSS組相比，長期給予TJ-M2010-5干預(yù)后，小鼠死亡率從53％降低至0%，惡性腫瘤發(fā)生率從100%降至0%，并進(jìn)一步抑制了CAC小鼠體重下降的趨勢，降低了結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖能力并促進(jìn)了上皮細(xì)胞凋亡，抑制了結(jié)腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展并降低了腫瘤惡性程度。同時(shí)，TJ-M2010-5干預(yù)抑制了細(xì)胞因子的分泌以及結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞和免疫細(xì)胞的浸潤，調(diào)節(jié)了結(jié)腸組織炎性微環(huán)境。
　　結(jié)論：異常的T