Th22細(xì)胞及相關(guān)因子在結(jié)直腸癌的表達(dá)及作用機(jī)理探討.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 Th22細(xì)胞及相關(guān)因子在結(jié)直腸腫瘤微環(huán)境的表達(dá)及臨床意義
　　目的：Th22細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型輔助性T細(xì)胞，在芳香族受體(AHR)的啟動(dòng)下主要分泌IL-22發(fā)揮功能作用，其早期研究主要集中在炎癥性疾病與自身免疫性疾，在結(jié)直腸腫瘤微環(huán)境中的作用機(jī)制尚不清楚。本部分檢測(cè)Th22細(xì)胞及相關(guān)因子在結(jié)直腸癌的表達(dá)分布情況，探討其可能機(jī)制及臨床意義。
　　方法：選取來(lái)自廣西醫(yī)

2、科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科2013年4月至2014年3月行結(jié)直腸癌切除手術(shù)的患者50例，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌，并且能夠經(jīng)手術(shù)切除腫瘤。所有患者在手術(shù)前均沒(méi)有接受放療或化療，術(shù)前無(wú)感染病史，既往無(wú)免疫性疾病病史，具有多個(gè)原發(fā)灶的患者也被排除?；颊哌M(jìn)行大腸癌手術(shù)切除時(shí)收集新鮮的腫瘤組織和癌旁組織（距離病灶5cm以上的正常大腸組織）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)免疫組化方法驗(yàn)證Th22細(xì)胞的功能因子IL-22在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中是否表達(dá);使

3、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織Th22細(xì)胞比例的變化，結(jié)合臨床病理資料分析其臨床意義;使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從基因水平證實(shí)檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中Th22細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)情況，探討Th22細(xì)胞分布差異的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)10例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中均存在IL-22蛋白的表達(dá)，但腫瘤組織中表達(dá)更為明顯。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，以散射光

4、FSC/SSC及CD4+T細(xì)胞亞群設(shè)門(mén)，分析Th22細(xì)胞的比例變化，結(jié)果顯示Th22細(xì)胞在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁的正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;受檢的結(jié)直腸癌組織中，TNMⅢ-Ⅳ期的Th22細(xì)胞比例明顯高于TNMⅠ-Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;提示Th22細(xì)胞結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中聚集，并且隨著腫瘤的進(jìn)展含量增高。分析在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中Th22細(xì)胞及Th17細(xì)胞的相關(guān)性顯示，結(jié)直腸癌組織中Th22細(xì)胞

5、的比例與Th17細(xì)胞的比例變化呈正相關(guān)，R=0.52，P＜0.05。
　　對(duì)50例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織的細(xì)胞因子進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參基因計(jì)算相關(guān)因子的相對(duì)表達(dá)量。已知Th22細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為AHR，主要分泌IL-22;其表型特征為CCR4、CCR6和CCR10，對(duì)應(yīng)的配體分別為CCL22、CCL20和CCL27。結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，Th22細(xì)胞的功能因子IL-22和轉(zhuǎn)錄因

6、子AHR結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯增高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;該結(jié)果與免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果保持一致。趨化因子CCL20和CCL22在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯比癌旁組織增高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，趨化因子CCL27在結(jié)直腸癌組織的相對(duì)表達(dá)量也較癌旁組織增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。提示腫瘤微環(huán)境中含有大量Th22細(xì)胞相關(guān)的趨化因子。
　　結(jié)論：Th22淋巴細(xì)胞表達(dá)存在于結(jié)直腸癌組織及癌旁正常大腸組織中

7、，Th22細(xì)胞在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中高度表達(dá)，并且隨著腫瘤的分期進(jìn)展比例增高;通過(guò)腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子分析表明，Th22細(xì)胞在結(jié)直腸癌中聚集，可能與腫瘤微環(huán)境所分泌的細(xì)胞因子對(duì)Th22細(xì)胞的趨化作用有關(guān)。
　　第二部分 IL-22在體外對(duì)大腸癌的作用研究
　　目的：通過(guò)IL-22在體外與結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行共培養(yǎng)，研究IL-22對(duì)大腸癌的作用，并使用STAT3抑制劑進(jìn)行干預(yù)，對(duì)其可能作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法：購(gòu)買(mǎi)人結(jié)腸

8、癌RKO細(xì)胞株，進(jìn)行復(fù)蘇、常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行種板培養(yǎng)，使用細(xì)胞因子進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞培養(yǎng)12孔板分為空白對(duì)照組、IL-22干預(yù)組、IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑干預(yù)組三個(gè)小組，觀(guān)察結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，使用凋亡試劑盒AnnxmⅤ PE和7-AAD觀(guān)察細(xì)胞凋亡比例;使用細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原物質(zhì)Ki-67抗體檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖比例;統(tǒng)計(jì)分析各組的差異。
　　結(jié)果：通過(guò)IL-22與

9、人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株在體外共培養(yǎng)或IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑(S3I-201)與人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株在體外共培養(yǎng)或來(lái)判斷IL-22在體外對(duì)結(jié)腸癌凋亡作用的影響及可能機(jī)制。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率我們可以發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，IL-22可以明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，降低凋亡率，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑與結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，IL-22抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用完全被逆轉(zhuǎn)，P

10、＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明Th22細(xì)胞的功能因子IL-22對(duì)大腸癌凋亡有抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)STAT3信號(hào)通路來(lái)完成的。
　　通過(guò)IL-22與人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株在體外共培養(yǎng)或IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑(S3I-201)與人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株在體外共培養(yǎng)或來(lái)判斷IL-22在體外對(duì)結(jié)腸癌增殖作用的影響及可能機(jī)制。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖比例我們可以發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，IL-22可以明顯促進(jìn)結(jié)腸

11、癌細(xì)胞的增殖，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑與結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，IL-22促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用完全被逆轉(zhuǎn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明Th22細(xì)胞的功能因子IL-22對(duì)大腸癌的增殖具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)STAT3信號(hào)通路來(lái)完成的。
　　結(jié)論：本部分研究通過(guò)IL-22與結(jié)腸癌細(xì)胞株體外共培養(yǎng)，闡明IL-22在結(jié)腸癌中起到促癌的作用，抑制了結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)增殖;其作用

12、效應(yīng)可以被STAT3抑制劑所逆轉(zhuǎn)，提示IL-22可能是通過(guò)STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮作用的。
　　第三部分 IL-22在小鼠大腸癌動(dòng)物模型的作用研究
　　目的：目前針對(duì)Th22細(xì)胞的功能研究主要是通過(guò)其功能因子IL-22來(lái)進(jìn)行，前面部分研究結(jié)果表明IL-22在體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株具有保護(hù)作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及抑制凋亡。本部分研究通過(guò)BALB/c裸鼠動(dòng)物建立結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，使用IL-22及STAT3抑制劑進(jìn)行干預(yù)，探

13、討IL-22在體內(nèi)對(duì)大腸癌生長(zhǎng)的作用及可能機(jī)制。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)期時(shí)消化，以生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度，注射在BALB/c裸鼠皮下，建立結(jié)腸癌小鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型。待小鼠腫瘤體積達(dá)到60mm3時(shí)隨機(jī)分成3組（A組:空白對(duì)照組，B組:IL-22， C組:IL-22+STAT3抑制劑）隔天進(jìn)行腹腔注射干預(yù)，隔天一次共5次，觀(guān)察各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，第11天頸椎脫臼法處死，完整切除腫瘤，游標(biāo)

14、卡尺測(cè)量計(jì)算終體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。稱(chēng)取一定量的小鼠腫瘤組織，進(jìn)行勻漿，收集組織勻漿上清液，使用液相芯片技術(shù)檢測(cè)各組小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量。
　　結(jié)果：本研究使用RKO結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行小鼠皮下結(jié)腸癌模型的建立成功，飼養(yǎng)1周后所有的BALB/c裸鼠均成瘤，皮下可以觸及;腫瘤體積達(dá)到60mm3時(shí)隨機(jī)分成3組，腹腔注射藥物進(jìn)行干預(yù)。三組小鼠在給藥過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，空白對(duì)照組小鼠腫瘤緩慢平穩(wěn)生長(zhǎng)，而IL-22干預(yù)組小鼠腫瘤生長(zhǎng)

15、迅速，與對(duì)照組相比，第11天時(shí)腫瘤體積明顯增大，638mm3±58mm3 vs.428mm3±51mm3，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而IL-22聯(lián)合S3I-201進(jìn)行給藥時(shí)，IL-22對(duì)小鼠結(jié)腸癌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯被逆轉(zhuǎn)，第11天時(shí)腫瘤體積顯著小于IL-22組，313mm3±38mm3 vs.638mm3±58mm3，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明IL-22可以在體內(nèi)促進(jìn)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)STAT3信號(hào)通路來(lái)

16、實(shí)施。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)IL-22在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌生長(zhǎng)的作用，我們對(duì)三組結(jié)腸癌小鼠皮下移植腫瘤進(jìn)行組織勻漿，通過(guò)Luminex液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量。結(jié)果表明，單獨(dú)IL-22干預(yù)組小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量明顯比空白對(duì)照組增高，124.1pg/ml±14.9pg/ml vs.25.36pg/ml±4.1pg/ml，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;然而，單獨(dú)IL-22干預(yù)組與IL-22聯(lián)合S3I-201干

17、預(yù)組小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量相比無(wú)明顯差別，124.1pg/ml±14.9pg/mlvs.118.3pg/ml±13.5pg/ml，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明IL-22確實(shí)在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中聚集并能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，與第一部分人體標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似。
　　結(jié)論：本部分研究通過(guò)BALB/c裸鼠建立結(jié)腸癌皮下移植瘤動(dòng)物模型，使用IL-22及STAT3抑制劑進(jìn)行干預(yù)，在體內(nèi)證實(shí)了IL-22對(duì)結(jié)腸癌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可