黃芪甲苷對(duì)TL1A高表達(dá)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠IL-9表達(dá)的影響.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前認(rèn)為腸黏膜免疫異常是IBD的重要病因之一，而CD4+T細(xì)胞是其免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，在維持 IBD免疫平衡中發(fā)揮著重要作用。Th9細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-9，近年研究發(fā)現(xiàn)，Th9細(xì)胞及IL-9在IBD發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，受到越來(lái)越多的關(guān)注。
　　IL-9具有廣泛的生物學(xué)活性，在過(guò)敏性疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

2、炎等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。盡管Th9細(xì)胞在諸多自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用，但目前有關(guān)Th9細(xì)胞在IBD領(lǐng)域的研究報(bào)道不多。研究發(fā)現(xiàn)，Th9細(xì)胞與IL-9水平在UC患者和動(dòng)物結(jié)腸炎模型中均明顯升高，并且與結(jié)腸炎病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。應(yīng)用IL-9基因敲除小鼠制備的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型腸道炎癥程度較WT組輕；應(yīng)用抗IL-9抗體腹腔注射治療急性結(jié)腸炎小鼠后，腸道炎癥下降。這些研究提示Th9細(xì)胞及其分泌的IL-9在IBD發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮

3、重要作用。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule1A，TL1A)是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子家族新成員，與死亡受體3（death receptor3，DR3）結(jié)合，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。目前，TL1A調(diào)控Th9細(xì)胞功能的研究報(bào)道不多，在過(guò)敏性肺炎的研究中發(fā)現(xiàn)，TL1A刺激Na(i)ve CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)其向Th9分化，產(chǎn)生IL-9增多。在IBD領(lǐng)域，

4、TL1A與Th9細(xì)胞及IL-9的關(guān)系尚未研究報(bào)道。
　　黃芪甲苷（AstragalosideⅣ, AS-Ⅳ）是黃芪（Astragalus membranaceus）藥理活性的主要物質(zhì)之一。黃芪在IBD的治療中應(yīng)用較為廣泛，治療UC已被證實(shí)有效。研究發(fā)現(xiàn)，TL1A在病毒性心肌炎中的表達(dá)升高，應(yīng)用AS-Ⅳ的干預(yù)后，能夠明顯下調(diào)TL1A表達(dá)，從而減輕心肌損害。目前尚無(wú)AS-Ⅳ與TL1A在IBD領(lǐng)域的研究。
　　目的：探討AS-Ⅳ對(duì)

5、TL1A高表達(dá)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的治療作用，明確AS-Ⅳ能否通過(guò)下調(diào)TL1A表達(dá)，抑制IL-9產(chǎn)生，以期為臨床IBD的治療提供一種新的有效藥物。
　　方法：
　　1.采用real-time Q-PCR方法進(jìn)行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鑒定與篩選。
　　2.通過(guò)硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium，DSS)建立慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，將L-Tg小鼠與C57BL/6WT小鼠（體重20～

6、22g，8-10周）分別隨機(jī)分為Control組、DSS組、AS-Ⅳ low dose組(20mg/kg.d)、AS-Ⅳ high dose組(30mg/kg.d)，每組10只。正常對(duì)照組引用蒸餾水，DSS組、AS-Ⅳ low dose組和AS-Ⅳ high dose組間斷飲用2％DSS，飲用DSS的時(shí)間段分別為第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天，第27、28天及其余時(shí)間飲用蒸餾水，共四周。AS-Ⅳ low dos

7、e組和AS-Ⅳ high dose組第14天開始給予黃芪甲苷灌胃治療。
　　3.每天觀察小鼠的一般狀況、體重變化、進(jìn)食以及大便情況，并評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index, DAI)。
　　4.觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化，測(cè)量結(jié)腸的長(zhǎng)度，計(jì)算結(jié)腸形態(tài)學(xué)評(píng)分以及組織病理學(xué)評(píng)分和結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)含量。
　　5.應(yīng)用Western blot技術(shù)和 real-t

8、ime Q-PCR技術(shù)分別檢測(cè)結(jié)腸組織中TL1A、DR3和IL-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平。
　　6.提取腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞(Lamina propria mononuclear cells,LPMC)，腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes,MLN)以及脾臟中的單個(gè)核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FC)檢測(cè) Th9細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例，應(yīng)用酶聯(lián)吸附反應(yīng)試驗(yàn)（enzyme-l

9、inked immune sorbent assay,ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液及血清中的IL-9的水平。
　　結(jié)果：
　?、俑鶕?jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列測(cè)定小鼠DNA，Tg小鼠目的基因測(cè)定成像在192bp位置，而WT小鼠基因測(cè)定成像，在192bp位置沒(méi)有檢測(cè)到目的基因，據(jù)此篩選并鑒定 Tg小鼠。
　?、谂cControl組相比，WT和Tg小鼠的DSS組小鼠體重明顯減輕，DAI評(píng)分明顯升高，結(jié)腸壁充血水腫

10、，長(zhǎng)度明顯縮短；結(jié)腸組織病理提示大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮形成淺潰瘍，病理評(píng)分明顯升高（WT小鼠：13.5±1.06 vs3.25±0.46, P<0.05；Tg小鼠：16.25±1.03 vs3.38±0.51,P<0.05）；MPO活性明顯升高(P<0.05)。與WT小鼠DSS組相比，Tg小鼠DSS組結(jié)腸炎癥明顯增加(P<0.05)。給予AS-Ⅳ治療后，與DSS組相比，WT和Tg小鼠的AS-Ⅳ low dose組和AS-Ⅳ high

11、 dose組小鼠體重明顯回升，DAI評(píng)分明顯下降，結(jié)腸腸壁充血水腫不明顯，長(zhǎng)度縮短不明顯；病理評(píng)分明顯降低（WT小鼠：8.75±0.88 vs13.5±1.06,P<0.05；6±1.06 vs13.5±1.06,P<0.05；Tg小鼠：11.38±1.06 vs16.25±1.03,P<0.05;9.12±0.83 vs16.25±1.03,P<0.05）；MPO活性明顯降低(P<0.05)。AS-Ⅳ high dose組小鼠治療效果

12、更佳，與AS-Ⅳlow dose組相比結(jié)腸炎癥明顯降低(P<0.05)。與Tg小鼠相比，WT小鼠治療效果更佳，結(jié)腸炎癥明顯降低(P<0.05)。
　?、踂estern blot和real-time Q-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中TL1A和IL-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與control組相比，WT和Tg小鼠的DSS組小鼠上述蛋白及mRNA水平明顯升高，WT小鼠（TL1A mRNA:0.58±0.038 vs0.01±0.02

13、,P<0.05；TL1A蛋白0.47±0.03 vs0.15±0.05,P<0.05；IL-9 mRNA:0.13±0.009 vs0.01±0.002,P<0.05；IL-9蛋白0.44±0.02 vs0.10±0.02,P<0.05）；Tg小鼠（TL1A mRNA:1.5±0.05 vs0.26±0.045,P<0.05；TL1A蛋白0.74±0.02 vs0.33±0.04,P<0.05； IL-9 mRNA:0.16±0.011

14、 vs0.02±0.005,P<0.05；IL-9蛋白0.73±0.02 vs0.30±0.02,P<0.05）。并且Tg小鼠較WT小鼠升高顯著(P<0.05)。給予AS-Ⅳ治療后，WT和Tg小鼠的AS-Ⅳ low dose組和AS-Ⅳ high dose組TL1A和IL-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，DR3蛋白及mRNA表達(dá)水平下降不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與AS-Ⅳ low dose組相比，WT

15、小鼠AS-Ⅳ high dose組IL-9蛋白及mRNA水平下降更明顯(P<0.05)，TL1A變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與AS-Ⅳ low dose組相比，Tg小鼠AS-Ⅳ high dose組TL1A、IL-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平均下降更明顯(P<0.05)。與Tg小鼠相比，WT小鼠治療效果更佳，TL1A和IL-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。
　?、芘ccontrol組相比，WT和T

16、g小鼠的DSS組小鼠LPMC、MLN中及脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯增加(P<0.05)，且Tg小鼠較WT小鼠增加顯著(P<0.05)。給予AS-Ⅳ治療后，WT和Tg小鼠的 AS-Ⅳ low dose組和AS-Ⅳ high dose組上述細(xì)胞數(shù)目明顯下降(P<0.05)。且與AS-Ⅳ low dose組相比，AS-Ⅳ high dose組的上述細(xì)胞數(shù)目下降更明顯(P<0.05)。與Tg小鼠相比，WT小鼠治療效果更佳，上述細(xì)胞數(shù)目下降更

17、明顯(P<0.05)。
　?、菖ccontrol組相比，WT和Tg小鼠的DSS組小鼠MLN中及脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞所包含的Th9細(xì)胞的比例明顯增加，WT小鼠（MLN中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例：3.64%±0.22% vs1.75%±0.021%，P<0.05；脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例：5.84%±0.1%vs3.38%±0.29%, P<0.05）；Tg小鼠（MLN中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例：9.63%±0.28% vs1.6

18、4%±0.13%，P<0.05；脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例：9.53%±0.27%vs2.36%±0.21%, P<0.05）。并且Tg小鼠較WT小鼠增加顯著(P<0.05)。給予AS-Ⅳ治療后，WT和Tg小鼠的AS-Ⅳ low dose組和AS-Ⅳ high dose組上述細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)。且與AS-Ⅳ low dose組相比，AS-Ⅳ high dose組的上述細(xì)胞比例下降更明顯(P<0.05)。與Tg小鼠相比，

19、WT小鼠治療效果更佳，上述細(xì)胞比例下降更明顯(P<0.05)。⑥ELISA檢測(cè)LPMC、MLN和脾臟中的單個(gè)核細(xì)胞上清液以及血清中的IL-9水平顯示：與control組相比， WT和Tg小鼠的DSS組小鼠LPMC、MLN和脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞上清液以及血清中的IL-9水平明顯升高，WT小鼠（LPMC分泌的IL-9水平：246.16pg/mL±6.14pg/mL vs26.16pg/mL±2.48pg/mL，P<0.05）；Tg小鼠（LP

20、MC分泌的IL-9水平：285pg/mL±6.78pg/mL vs30.16pg/mL±3.65pg/mL，P<0.05）。并且Tg小鼠較WT小鼠升高顯著(P<0.05)。給予AS-Ⅳ治療后，WT和Tg小鼠的AS-Ⅳ low dose組和AS-Ⅳ high dose組IL-9水平明顯下降(P<0.05)。且與AS-Ⅳ low dose組相比，AS-Ⅳ high dose組的IL-9水平下降更明顯(P<0.05)。與Tg小鼠相比，WT小鼠