基因工程菌gs115ppic9kchia4.0發(fā)酵生產(chǎn)hasnpv幾丁質(zhì)酶的研究

1、西北大學(xué)碩士學(xué)位論文基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA4.0發(fā)酵生產(chǎn)HaSNPV幾丁質(zhì)酶的研究姓名：王振虎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：惠有為20100611A b s t r a c tC h i t i n a s eC a l l d e c o m p o s e c h i t i n s p e c i f i c a l l y ．A sb i o l o g i c a l i n s e c t

2、i c i d e ，c h i t i n a s ei s n oh a r m t oa n i m a l s ．H e l i c o v e r p aa r m i g e r a s i n g l e —n u c l e o c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ( H a S N P V )i s ak i n d o fb o l l w o r m

3、 —s p e c i f i c p a t h o g e n i cm i c r o —o r g a n i s m ，c h i t i n a s e a s i t s s e c r e t i o nC a ni n h i b i t o rk i l lt h e i n s e c t s ．T h e l a b o r a t o r y h a s b e e n s t u d y i n g t h

4、er e c o m b i n a t i o n ，t r a n s f o r m a t i o na n d e x p r e s s i o n o f H a S N P V g e n e ，t h eg o a l i st od e v e l o p n o n —t o x i cb i o - p e s t i c i d e ．P r o d u c t i o no f H a S N P V c h

5、 i t i n a s eb y g e n ee n g i n e e r i n g b a c t e r i aG S l 15 - p P I C 9 k - C h i A 4 ．0w a s s t u d i e di nt h ep a p e r ．M a i n l yi n c l u d e do p t i m a lc o n d i t i o n ，s c a l e —u pc u l t i v

6、 a t i o n ，s e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n , a s w e l la st h et o x i c o l o g y o fH a S N P V c h i t i n a s e ．O n t h el e v e l o fs h a k e —f l a s k ，f e r m e I l t a t i o nc o n d i t i o

7、 n sa n d p r o p o r t i o n o f m a i nc o m p o n e n t si ni n d u c t i o nm e d i u mw e r er e s e a r c h e d ．T h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o re x p r e s s i o no fc h i t i n a s ew e r ea sf o l l o

8、 w s ：T h e s t r a i n w a s c u l t u r e d f o r 16 h ～1 8 h i nB M G Y m e d i u mQ H 6 ．0 ，3 0 “ C ，2 5 0 r p m ) ，t h e n ，r e s u s p e n d e d i ni n d u c t i o n m e d i u m ( P E P 2 ％，Y N B1 ．3 4 ％，Y EO ．5 ％，

9、m e t h a n o l1 ％，o l e i ca c i d0 ．0 5 ％，p H6 ．O ) ．D u r i n gt h ei n d u c t i o np h a s e ，a d d i n gm e t h a n o la n dg l y c e r o l( 2 0 ：1 ) p e r6 h ，2 9 “ C ，2 5 0 r p mf o r12 0 h ．F i n a l l y , t h e

10、c h i t i n a s ec o n c e n t r a t i o n W a s17 3 ．5 U ／m L ．T h e n ．5 Lf e r m e n t e r W a s u s e df o rp r i m a r y s c a l e —u pc u l t i v a t i o n ．C e l lc o n c e n t r a t i o ns h o u l dr e a c ha b o

11、 u t6 0 9 ／Lb e f o r e i n d u c t e d ．I nt h ei n d u c t i o np h a s e ，k e e p e dD O o n2 0 ％t o3 0 ％w a sb e n e f i c i a lt ot h ee x p r e s s i o no fc h i t i n a s e ．M e t h a n o l - G l y c e r o l a l t

12、 e m a t e df e e d sc o u l df u r t h e re n h a n c e c h i t i n a s ec o n c e n t r a t i o n ，t h e f i n a l l e v e lw a s 3 7 2 U ／m L ．T h es u p e m a t a n tW a s s a l t e d o u t w i t h ( N H 4 ) 2 S 0 4a

13、 n dp u r i f i e d w i t h a n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ．T h ec h i t i n a s ec o n c e n t r a t i o n W a s 2 8 8 5 ．1 U ／m L ．a(chǎn) n dt h er e c o v e r y w a s 6 9 ．8 ％．B a s e d o nc o n t a

14、 c ta c t i o na n d s t o m a c ht o x i c i t y t e s to nP l u t e l l ax y l o s t e l l ，t h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e sw e r eo b s e r v e db yS E M a n dT E M ．C h i t i n i nc e l lw a l lw a s d e c o

15、 m p o s e d b yH a S N P Vc h i t i n a s e ，w h i c hc a u s e d l i q u e f a c t i o no f t i s s u e ，r e s u l t i n g i n g r o w t hr e t a r d a t i o n o rw o r m ’s d e a t h ．H a S N P V c h i t i n a s eh a

16、di n h i b i t i o no nf i v ek i n d so fc o m m o np a t h o g e n i cf u n g i ，w h i c hi n c l u d e d T o m a t o b o t r y t i s c i n e r e a ，W h e a tc o m m o nr o t p a t h o g e n ，T o b a c c o b r o w ns p

17、 o tp a t h o g e n ，T o m a t oa l t e r n a r i as o l a n ia n d C o l l e t i t r i c h u mg l o e o s p o r i o d e s ．K e y w o r d sP i c h i a p a s t o r i s ；H a S N P V c h i t i n a s e ；F e r m e n t a t i o