gs115ppic9kchia4.0工程菌產(chǎn)hasnpv幾丁質(zhì)酶的條件優(yōu)化、產(chǎn)物分離及毒理學(xué)研究

1、西北大學(xué)碩士學(xué)位論文GS115-pPIC9k-ChiA 4.0工程菌產(chǎn)HaSNPV幾丁質(zhì)酶的條件優(yōu)化、產(chǎn)物分離及毒理學(xué)研究姓名：賈靜芳申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：惠有為20090610O p t i m i z a t i o n o f F e r m e n t a t i o n C o n d i t i o n s ，P u r i f i c a t i o na n d T o x i c o l o g y

2、 A n a l y s i so f C h i t i n a s ef r o mG S I I 5 - p P I C 9 k —- C h i A 4 ．0A b s t r a c tH e l i c o v e r p aa r m i g e r as i n g l en u c l e o c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ( H a S N P

3、V ) p a r a s i t i z e so n H ．a(chǎn) r m i g e r a , a n da c t s a sh y d r o l y z i n g t h e c u t i c l ea n dp e r i t r o p h i cm e m b r a n e so f i n s e c t sb yc h i t i n a s et oi n h i b i t t h e i rg r o w

4、 t h a n d b r e e d i n g ．T h e g e n e —e n g i n e e r e d s t r a i nh a sb e e nc o n s t r u c t e db yc o n s t r u c t i n gc h i t i n a s eg e n ef r o mH a S N P V i n t oe x p r e s s i o n v e c t o r p P I

5、 C 9 ka n d t r a n s f e r r i n gi n t oe x p r e s s i o n h o s tP i c h i a p a s t o r i sG S ll5 ．M o r e o v e r , m u l t i c o p yr e c o m b i n a n to fG S ll5 - p P I C 9 k - C h i A w a ss c r e e n e da n

6、dt h eo p t i m i z a t i o n o ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，p u r i f i c a t i o na n d t o x i c o l o g y a n a l y s i so fc h i t i n a s ef r o m G S 115 ·- P p i c 9 k - - C h i A 4 ．0W a s

7、p e r f o r m e di nt h i ss t u d y ．M e t h a n o l u t i l i z a t i o n p l u s ( M u t + ) t r a n s f o r m a n tw a ss c r e e n e d b yM M a n dM Dp l a t ec u l t u r e ．T h e r e c o m b i n a n t G S 115 一p P

8、I C 9 k - C h i A 4 ．0 w h i c h c o n t r a d i c t s 4 ．0 m g ·m L ' lG e n e t i c i n ( G 4 18 ) w a so b t a i n e d w i t hc o n c e n t r a t i o ng r a d i e n to f G 4 18 ．A c c o r d i n gt om o d i f

9、i e dS c h a l e s ，6 7 ．7 4 U ·m L - 1c h i t i n a s ea c t i v i t yi nf e r m e n t a t i o nc u l t u r eW a so b t a i n e da f t e ri n d u c i n gb y m e t h a n 0 1 ．S i n g l e —f a c t o r d e s i g n a n

10、 d o r t h o g o n a l t e s t w e r e e m p l o y e d f o r o p t i m i z i n g c u l t u r a lc o n d i t i o n s ．T h e b e s tc u l t i v a t i n gc o n d i t i o nw a s P E P 2 ％，Y N B0 ．6 7 ％，m e t h a n o l 1 ．5 ％

11、，Y E1 ．5 ％，p H 6 ．0i ni n d u c t i v em e d i u m a n d a d d i n gm e t h a n o l t o 1 ．5 ％p e r2 4 h ，2 5 0 r p m ，1 2 0 h o u r si n d u c e m e n t i n3 0 ℃，i nw h i c h c h i t i n a s ea c t i v i t yW a s 1 3 3

12、．7 0 U ·m L - 1 ．T h es u p e m a t a n to f f e r m e n t a t i o nw a ss a l t e do u tw i t h ( N H 4 ) 2 S 0 4 ．T h ep r e c i p i t a t ew a sc e n t r i f u g a l i z e df o r2 5 m i n i n4 “ C a n d13 0 0 0 r

13、 p m ．T h ep r e c i p i t a t ei n6 0 ％．．- 9 0 ％s a t u r a t i o nw a sc o l l e c t e dw h i c hw a s p u r i f i e d w i t hD E A E - - S e p h a r o s e ··F a s t F l o wc h r o m a t o g r a p h yw h i c

14、hw a se q u i l i b r a t e dw i t h2 5 m m o l ·L ．1 N a 2 H P 0 4 一K H 2 P 0 4 ( p H8 ．0 ) ．P r o t e i n p e a k sw e r ed i l u t e dw i t h0 ．1M N a C li n2 5 m m o l ·L - 1N a 2 H P 0 4 一K H 2 P 0 4 ( p H

15、8 ．O ) ．W h e nv e l o c i t ya n d s a m p l ev o l u m e sW a s 7 6 ．4 c m ·h 。1 a n d3 ．7 m L ，r e s p e c t i v e l y ．2 ．7 9 5 m gc h i t i n a s eW a s o b t a i n e dp e r10 0 m L c u l t u r ea n d t h e e n