抗腫瘤工程菌Nissle1917發(fā)酵工藝優(yōu)化及菌粉制劑制備.pdf

1、近年來，隨著腫瘤發(fā)病率的逐年升高，對有效治療腫瘤的新型藥物的研究越來越受到重視，其中利用細菌載體靶向腫瘤的治療成為研究的熱點。人體腸道益生菌E.coli Nissle1917(EcN)對腫瘤細胞具有很強的靶向性，是理想的抗腫瘤藥物靶向載體。本文對本室構(gòu)建的能靶向侵襲腫瘤細胞并分泌抗腫瘤藥物天青蛋白(Azurin)的工程菌株EcNA進行發(fā)酵條件的研究和菌劑的研制。
　　為了充分發(fā)揮EcNA的抗腫瘤活性功能，研究中采用高密度發(fā)酵及真空

2、冷凍干燥技術(shù)，試圖獲得高活力抗腫瘤工程菌菌粉。在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗篩選出對菌體濃度影響最顯著的因素為酵母抽提物和K2HPO4。以發(fā)酵后菌體濃度的OD600為響應值，對實驗結(jié)果進行中心組合試驗響應面分析，得到最佳培養(yǎng)基成分組合為可溶性淀粉2g/L、酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO414.26g/L、KH2PO43 g/L、MgSO40.3 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量3％。發(fā)酵后菌

3、液OD600值達到7.602，菌體生物量達到2.96×109CFU/mL，較優(yōu)化前提高了78.3％。其后，為減小冷凍干燥過程對菌體活力的影響，采用正交設計對復合凍干保護劑進行優(yōu)化，得到最佳保護劑配方為脫脂乳14.25％、蔗糖3％、抗壞血酸鈉3％，優(yōu)化后菌粉存活率達到86.32％。根據(jù)菌粉流動性較差、易潮解的性質(zhì)，以淀粉漿為輔料，成功將菌粉壓制成片劑。同時，以蔗糖為填充物料，將菌粉灌裝制成硬膠囊劑。
　　將工程菌菌粉復水并進行SDS

4、-PAGE檢測、細胞活性檢測和穩(wěn)定性檢測。SDS-PAGE的檢測結(jié)果顯示，EcNA菌劑的活性未受高密度發(fā)酵及冷凍干燥的影響，天青蛋白能正常表達且含量較高。細胞活性檢測結(jié)果表明，復水菌粉破碎上清液對人體正常細胞HUVEC的生長無影響，對小鼠4T1乳腺癌細胞和小鼠B16黑色素瘤細胞的生長有顯著抑制作用，菌粉顯示出很好的抗腫瘤活性。對菌粉進行穩(wěn)定性檢測實驗發(fā)現(xiàn)菌粉在4℃條件下保存三個月，菌粉存活率保持在80％以上，這一結(jié)果為該抗腫瘤活菌藥物的