沼澤紅假單胞菌輔酶Q10發(fā)酵過程工程研究.pdf

1、CoQ10是一種存在于人體細(xì)胞內(nèi)的天然脂溶性物質(zhì)。其擔(dān)負(fù)著重要的生理生化作用,比如是呼吸鏈中重要的電子載體,也是生物體中一種重要的抗氧化劑而使細(xì)胞膜脂免于過氧化和保持細(xì)胞膜功能的穩(wěn)定性等。由于CoQ10具有多方面作用,因此目前它有多方面的臨床應(yīng)用,如用于治療高血壓、腦血管損傷、貧血癥、肌肉萎縮癥及牙槽膿溢等。CoQ10越來越受到人們的重視,其消耗量正逐年上升。微生物法是目前生產(chǎn)CoQ10的主要方法,其產(chǎn)品比化學(xué)法安全可靠且生物利用度高,

2、因此售價(jià)要好。
　　本研究用Van Niel紫色非硫光合細(xì)菌富集培養(yǎng)基對(duì)采自武漢市東湖污泥進(jìn)行厭氧光照培養(yǎng),并用Van Nile紫色非硫細(xì)菌分離用培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離,獲得1株菌落生長旺盛且CoQ10含量較高的菌株(5.2mg·g-1),對(duì)其進(jìn)行了菌株形態(tài)、生理生化及分子鑒定和遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明該菌株歸屬于沼澤紅假單胞菌,擬命名為沼澤紅假單胞菌J(Rhodopseudomonas palustris J)。
　　以沼

3、澤紅假單胞菌J為出發(fā)菌株,采用基于高通量篩選技術(shù)的高效定向育種方法,設(shè)計(jì)出抗高濃度對(duì)羥基苯甲酸,抗L-乙硫氨酸與抗維生素K3三種篩選方法,比較高效地定向選出具有三抗特性的突變株J001,其輔酶Q10含量達(dá)19.3mg·g-1,是出發(fā)菌株J的3.71倍,且遺傳穩(wěn)定性良好。
　　通過以生物量及輔酶Q10合成為考察指標(biāo)對(duì)沼澤紅假單胞菌J001250ml搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明其發(fā)酵最佳pH值為6.5-7.5,溫度為28-31℃,

4、搖床轉(zhuǎn)速100r·min-1,搖瓶裝液量為200ml,接種量達(dá)10％時(shí)可直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期;碳源以NaAc較好,氮源以(NH4)2SO4和NH4Cl較好,磷源用量對(duì)考察指標(biāo)影響不明顯;用中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面法對(duì)碳氮源用量進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)NaAc濃度X1=5.39(g·l-1),(NH4)2SO4濃度X2=0.385(g·l-1)即碳氮比為14/1時(shí),生物量Y1有極大值為1.012±0.041(g·l-1);當(dāng)X1=5.70(g·l-1),

5、X2=0.365(g·l-1)即碳氮比為15.6/1時(shí),輔酶Q10產(chǎn)量Y2有極大值為19.8±0.6(mg·l-1)。不同供氧量試驗(yàn)結(jié)果表明,相對(duì)較高的供氧量,利于沼澤紅假單胞菌J001菌體的生長,而較低的供氧量有利于菌胞輔酶Q10含量的提高。采用具有先強(qiáng)后弱自調(diào)氧氣作用的密閉玻璃瓶試驗(yàn),最佳裝液比為40%,生物量及輔酶Q10含量與產(chǎn)量分別為0.940g·l-1,76.4mg·g-1,71.8mg·l-1,與200ml裝液量搖瓶發(fā)酵處理

6、相比較,除生物量接近外,其輔酶Q10含量與產(chǎn)量高達(dá)搖瓶發(fā)酵的3.86和3.82倍;采用分段供氧和補(bǔ)加不同量醋酸鈉的兩步發(fā)酵模式進(jìn)行了5升發(fā)酵罐試驗(yàn),結(jié)果表明在細(xì)胞生長期間(對(duì)數(shù)生長末期前)維持45%的溶氧量,對(duì)數(shù)生長末期后(接種后培養(yǎng)42h)調(diào)至15%的溶氧量并補(bǔ)加2.0%的醋酸鈉效果最好,其最大生物量為1.31g·l-1,比始終保持45%DO的分批發(fā)酵提高28%;最大輔酶Q10產(chǎn)量為89.1mg·l-1,比45%DO的分批發(fā)酵提高5.

7、85倍;總的輔酶Q10生產(chǎn)速率為1.142mg·l-1·h-1,比45%DO的分批發(fā)酵提高4.26倍。
　　對(duì)輔酶Q10的發(fā)酵過程進(jìn)行了檢測,并通過計(jì)算機(jī)軟件處理,得到了沼澤紅假單胞菌J001搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的細(xì)胞生長、底物消耗和產(chǎn)物生成三個(gè)動(dòng)力學(xué)方程。
　　通過添加對(duì)莽草酸途徑、PPP途徑、甲硫氨酸途徑中的某些酶的活性或合成有影響的物質(zhì),開展了輔酶Q10代謝調(diào)控的研究。結(jié)果表明:A色氨酸對(duì)輔酶Q10的合成有較強(qiáng)的抑制

8、作用,培養(yǎng)基期間添加苯丙氨酸(100mg·l-1)+酪氨酸(150mg·l-1)有利于該菌株輔酶Q10的合成,提高29.3%輔酶Q10產(chǎn)量。B蘇氨酸、異亮氨酸與賴氨酸對(duì)輔酶Q10的合成有抑制作用,說明菌株J001的天門冬氨酸激酶也受蘇氨酸、異亮氨酸與賴氨酸的抑制或阻遏,從而影響到甲硫氨酸合成,最終影響輔酶Q10的合成。Cβ-胡蘿卜素和番茄紅素對(duì)菌株J001輔酶Q10生物合成有抑制作用,抑制濃度均為:≥25mg·l-1,番茄紅素的抑制效果

9、大于β-胡蘿卜素;而茄尼醇有促進(jìn)作用,單獨(dú)添加時(shí)以125mg·l-1較好,可提高輔酶Q10產(chǎn)量29.8%。D茄尼醇、對(duì)羥基苯甲酸、甲硫氨酸分別是PPP途徑、莽草酸途徑、甲硫氨酸途徑的代謝產(chǎn)物,是生物合成輔酶Q10所需醌核環(huán)、癸異戊二烯側(cè)鏈、甲基供體SAM三者的直接原料。通過響應(yīng)曲面法研究了茄尼醇(X1)、對(duì)羥基苯甲酸(X2)和甲硫氨酸(X3)三因素對(duì)菌株J001輔酶Q10產(chǎn)量(Y)的協(xié)同影響和進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)茄尼醇124.8mg·l-1,對(duì)