5-氨基乙酰丙酸工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid,簡稱ALA）是一種廣泛存在于動植物細(xì)胞和微生物中的氨基酸衍生物，是合成吡咯類化合物的重要中間體物質(zhì)。ALA在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，ALA可應(yīng)用于除草劑、殺蟲劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑等領(lǐng)域，具有容易降解、殘留低等優(yōu)點(diǎn)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，ALA可以用于治療皮膚癌、膀胱癌、直腸癌等各類癌癥。因其具有治療效果好、毒副作用小、治療確切穩(wěn)定等特點(diǎn)。故其在未來癌癥治療領(lǐng)域?qū)⒂袕V泛

2、深入的應(yīng)用。所以，對ALA的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用將有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
　　目前ALA主要通過化學(xué)合成和微生物發(fā)酵生產(chǎn)，其中化學(xué)合成生產(chǎn)方法具有過程復(fù)雜、廢水處理困難、產(chǎn)物收率不高等缺點(diǎn)。隨著人們環(huán)保意識的加強(qiáng)，化學(xué)合成法有望近期被微生物發(fā)酵法替代。但目前微生物發(fā)酵法產(chǎn)量較低，還不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。隨著近年來對微生物菌株的遺傳改造，以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化等一系列成果的轉(zhuǎn)化，有望突破現(xiàn)在的瓶頸，實(shí)現(xiàn)ALA微生物發(fā)酵法的工業(yè)化

3、生產(chǎn)。
　　本課題以畢赤酵母GS115為工程菌株，通過同源重組的方式，將釀酒酵母的5-氨基乙酰丙酸合酶的基因以組成型表達(dá)的方式整合入畢赤酵母GS115的基因組中。成功構(gòu)建了高產(chǎn)ALA的畢赤酵母轉(zhuǎn)基因工程菌株UJNPA，其生產(chǎn)ALA的產(chǎn)量比未進(jìn)行基因改造的菌株產(chǎn)量增加2倍。在本課題中選用的重組載體為pGAPZA，啟動子為pGAP。
　　然后，以構(gòu)建的菌株UJNPA為出發(fā)菌株，選擇與ALA代謝途徑有關(guān)的6種因素作為考察因子:琥珀

4、酸、甘氨酸、丙二酸、大蒜提取物、乙酰丙酸、甘油。研究這6種因素在發(fā)酵后期添加量對ALA產(chǎn)量的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得出其最優(yōu)添加量為:琥珀酸6.11g/L、甘氨酸1.67g/L、丙二酸2.46g/L、大蒜提取物7.24mL/L、乙酰丙酸1.50 g/L、甘油8.00mL/L。在此最優(yōu)添加量條件下，ALA的搖瓶產(chǎn)量為1783.33mg/L。在上述優(yōu)化條件下，以甲醇為輔助碳源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，間隔12h補(bǔ)加2％(v/v)的甲醇，最