產(chǎn)異戊二烯大腸桿菌工程菌YJM23發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、異戊二烯(isoprene)是萜烯家族最簡(jiǎn)單的單體物質(zhì),其聚合物在橡膠、食品、香料、航空燃料、有機(jī)殺蟲(chóng)劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛用途。鑒于現(xiàn)行生產(chǎn)異戊二烯的石油資源日益枯竭和高污染等缺點(diǎn),生物法產(chǎn)異戊二烯受到格外關(guān)注。然而植物、微生物在自然條件下生產(chǎn)異戊二烯量極少且收集困難,且受到氣候和生長(zhǎng)周期影響,采用基因工程手段利用微生物生產(chǎn)異戊二烯有著樂(lè)觀前景。大腸桿菌以清晰的遺傳背景、技術(shù)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)被選作宿主菌生產(chǎn)異戊二烯。研究大腸桿菌新建工程菌

2、的發(fā)酵工藝、優(yōu)化發(fā)酵條件對(duì)提高異戊二烯產(chǎn)量及工藝優(yōu)化有重要意義。
　　本課題對(duì)所構(gòu)建的產(chǎn)異戊二烯工程大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒和雙酶切遺傳特征的分子鑒定;對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物分離純化,利用核磁共振技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定;建立產(chǎn)物量化分析方法。DNA凝膠電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒大小和酶切片段大小和理論值一致,工程菌構(gòu)建成功;核磁共振檢測(cè)結(jié)果顯示產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)為異戊二烯;建立了用氣象色譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行量化分析的方法,建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=747.80+38651.65

3、X。
　　發(fā)酵初期在搖瓶水平對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。起始,對(duì)重要碳氮源和有機(jī)酸進(jìn)行了篩選,篩選出葡萄糖、牛肉浸膏和檸檬酸為對(duì)異戊二烯產(chǎn)量有重要影響的碳氮源和有機(jī)酸。接著對(duì)培養(yǎng)基各組分進(jìn)行單因素優(yōu)化,確定各因素最優(yōu)范圍:牛肉浸膏6g/L-8g/L,葡萄糖15g/L-25g/L,硫酸鎂0.2mL/L-0.8mL/L,檸檬酸鐵銨0.2g/L-0.4g/L,一水合檸檬酸1.1g/L-3.1g/L,微量元素溶液0.7mL/L-1.1mL/L

4、,三水合磷酸氫二鉀5g/L-15g/L;利用8因素2水平的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基各組分進(jìn)行了篩選,確定了牛肉膏、微量元素混合液和磷酸氫二鉀為影響異戊二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵因素;利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn),縮小3種關(guān)鍵因素的最佳響應(yīng)范圍為:牛肉浸膏:6.5g/L-8.5g/L、微量元素混合液:0.047mL/L-0.153mL/L、K2HPO4·3H2O:9.8g/L-13.4g/L;最后采用基于中心組合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法構(gòu)建了三元二次

5、方程;確定了最佳培養(yǎng)基配比:K2HPO4·3H2O,10.9g/L,葡萄糖20g/L,牛肉膏7.7g/L,C6H8O7·H2O6.3g/L,FeC6H5O70.3g/L,MgSO40.5mmol/L,(NH4)2SO41g/L,異戊二烯產(chǎn)量從140.16mg/L提高到935.02mg/L,與出發(fā)培養(yǎng)基相比提高了567.11％。
　　對(duì)氨水和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH做了考察,確定氨水為最佳初始pH調(diào)節(jié)劑;對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化,確定