農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)

1、農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)質(zhì)粒載體系統(tǒng)中最常用的質(zhì)粒有：Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒存在于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens）中，Ri質(zhì)粒存在于發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenis）中。Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒在結(jié)構(gòu)和功能上有許多相似之處，具有基本一致的特性。但實(shí)際工作中，絕大部分采用Ti質(zhì)粒。農(nóng)桿菌質(zhì)粒是一種能實(shí)現(xiàn)DNA轉(zhuǎn)移和整合的天然系統(tǒng)。Ti質(zhì)粒有兩個(gè)區(qū)域：TDNA區(qū)（是質(zhì)粒上能夠轉(zhuǎn)移整合入植物受

2、體基因組并能在植物細(xì)胞中表達(dá)從而導(dǎo)致冠癭瘤的發(fā)生，且可通過減數(shù)分裂傳遞給子代的區(qū)域）和Vir區(qū)（編碼能夠?qū)崿F(xiàn)TDNA轉(zhuǎn)移的蛋白）。TDNA長度為1224kb之間，兩端各有一個(gè)含25bp重復(fù)序列的邊界序列，在整合過程中左右邊界序列之間的TDNA可以轉(zhuǎn)移并整合到宿主細(xì)胞基因組中，研究發(fā)現(xiàn)只有邊界序列對DNA的轉(zhuǎn)移是必需的，而邊界序列之間的TDNA并不參與轉(zhuǎn)化過程，因而可以用外源基因?qū)⑵涮鎿Q。Vir區(qū)位于TDNA以外的一個(gè)35kb內(nèi)，其產(chǎn)物對

3、TDNA的轉(zhuǎn)移及整合必不可少。農(nóng)桿菌侵染植物首先是吸附于植物表面?zhèn)?，受傷植物分泌的酚類小分子化合物可以誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)。Vir產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生一條新的TDNA單鏈分子。此單鏈分子從Ti質(zhì)粒上脫離后，可以與Vir產(chǎn)物VIRD2蛋白共價(jià)結(jié)合，并在VIRD4和VIRB等蛋白的幫助下從農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞的染色體中。由于野生型Ti質(zhì)粒過于龐大，約200800kb，為了便于重組DNA操作，研究人員對Ti質(zhì)粒進(jìn)行了改造從而構(gòu)建一系列合適的

4、Ti衍生載體。首先除掉了野生型Ti質(zhì)粒TDNA區(qū)的一段DNA片段。例如：參與植物Ti通過體外操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看可分為兩類中間載體：即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元系統(tǒng)中間載體。根據(jù)兩類中間載體，目前已開發(fā)出兩類轉(zhuǎn)化體系：一類是一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)），這一類載體系統(tǒng)由一個(gè)共整合系統(tǒng)中間表達(dá)載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒組成。在農(nóng)桿菌內(nèi)，通過同源重組將外源基因整合到修飾過的TDNA上，形成可穿梭的共整合載體，在Vir基因

5、產(chǎn)物的作用下完成目的基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合。但這類方法構(gòu)建困難，整合體形成率低，一般不常用。另一類轉(zhuǎn)化體系是雙元載體系統(tǒng)，它由兩個(gè)分別含有TDNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)?！⑿蚑i質(zhì)粒（miniTiplas）和輔助Ti質(zhì)粒（helperTiplas）構(gòu)成，TDNA和Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過反式激活TDNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞基因組內(nèi)。微型Ti質(zhì)粒就是含有TDNA邊界但缺失Vir基因的Ti質(zhì)粒，為一個(gè)廣譜質(zhì)粒。它含有一個(gè)廣

6、泛寄主范圍質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)（iV），同時(shí)具有選擇性標(biāo)記基因。輔助質(zhì)粒為含有Vir區(qū)段但TDNA缺失的突變型質(zhì)粒，完全喪失了致瘤的功能。因此相當(dāng)于共整合載體系統(tǒng)中的卸甲質(zhì)粒。其作用是提供Vir基因功能。激活處于反式位置上的TDNA轉(zhuǎn)移。將微型質(zhì)位轉(zhuǎn)入到含有輔助性Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌的途徑有兩條：一條是直接用純化的微型Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；另一條途徑是采用三親交配方法，三親交配由含微型Ti質(zhì)粒的E.coli、含有助動(dòng)質(zhì)粒pRK