水稻條斑病菌內(nèi)源質(zhì)粒分析與穿梭質(zhì)粒載體的構建.pdf

1、細菌質(zhì)粒是獨立于染色體外可自主復制的遺傳物質(zhì)，大多為環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒上往往攜帶有抗生素抗性、重金屬抗逆性及功能蛋白分泌系統(tǒng)等功能相關基因，可幫助宿主菌適應生存環(huán)境;而質(zhì)粒的自主復制與轉(zhuǎn)移能力又使其具備作為基因工程載體的潛力?；蚬こ梯d體在黃單胞菌的致病機理研究及黃原膠、胞外蛋白酶的合成研究中均有著至關重要的作用。本研究以水稻條斑病菌（Xanthomonasoryzae pv.oryzicola，Xoc）為研究對象，基于水稻條斑病

2、菌中首個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源質(zhì)粒pXOCgx01的序列信息，開展了質(zhì)粒普查分析和基因工程載體的構建工作。
　　1.在v57株來自全國不同地區(qū)的分離株中共普查得到9種質(zhì)粒，分別命名為pXOCgx02、pXOCB116、pXOCB209、pXOCB216、pXOCB220、pXOCB409、pXOC709、pXOC820和pXOC905。對普查到的質(zhì)粒進行功能鑒定，結果發(fā)現(xiàn):pXOCB209可能具有重金屬抗逆性、轉(zhuǎn)座基因及Ⅳ型分泌系統(tǒng)，pXO

3、Cgx02和pXOC905可能具有Ⅳ型分泌系統(tǒng)，pXOCB116、pXOCB216和pXOCB220可能攜帶轉(zhuǎn)座基因，而pXOCB409、pXOC709與pXOC820上未檢測到重金屬抗逆性、轉(zhuǎn)座及Ⅳ型分泌系統(tǒng)相關功能基因。這表明Xoc的內(nèi)源質(zhì)粒各有不同的功能結構，但部分功能上仍具有一定的相似性。
　　2.目前，在黃單胞菌中常用的基因工程載體均不是由黃單胞菌屬細菌的質(zhì)粒改造而成，不能充分滿足黃單胞菌功能基因組學發(fā)展的需要。本研究通

4、過對質(zhì)粒pXOCgx01的序列分析，為構建適于黃單胞菌的基因工程載體對pXOCgx01進行了一系列改造:通過剪切重組去除原始質(zhì)粒上可能與質(zhì)粒復制無關的序列，引入抗性篩選標記、多克隆位點和復制起始位點oriVpMB1、oriV等質(zhì)粒載體必備功能基因。由53 kb的原始質(zhì)粒pXOCgx01構建得到兩個約11.6 kb的穿梭質(zhì)粒載體pXUG和pXUK，大大減小質(zhì)粒載體自身分子量。其中，pXUG具有慶大霉素抗性，pXUK具有卡那霉素抗性。在此基

5、礎上，分別用pXUG對Xoc GX01的胞外多糖缺陷型菌株進行互補，用pXUK對Xoc GX01的胞外蛋白酶缺陷型菌株進行互補，結果表明:兩個穿梭質(zhì)粒載體均可將缺陷型的表型補回野生型水平。對pXUG和pXUK的穩(wěn)定性進行驗證，檢測證實:穿梭質(zhì)粒載體pXUG和pXUK均可在大腸桿菌和稻黃單胞菌中穩(wěn)定復制、有效表達，且?guī)缀醪挥绊懢曜陨肀硇汀?br>　　綜上所述，本研究通過Xoc中國分離株中質(zhì)粒的普查、序列分析、功能調(diào)查、質(zhì)粒改造，為Xoc