農(nóng)桿菌抗蟲基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及其對水稻TP309的轉(zhuǎn)染研究.pdf

1、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）是一種革蘭陰性菌，在自然情況下可以通過傷口侵染植物?！稗r(nóng)桿菌—植物”間基因轉(zhuǎn)移促使了第一株轉(zhuǎn)基因植株的誕生。目前，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化仍然是轉(zhuǎn)化植物實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的主要方法，其毒性基因（vir）在此過程中扮演著重要角色。毒性基因通常存在于Ti質(zhì)粒，這套系統(tǒng)使得T—DNA能攜帶外源基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物的基因組。 水稻（OryzaStiva）是世界上最重要的糧食作物之一，我國一半以上人口以稻米為主食。每年蟲害造

2、成水稻的減產(chǎn)，給糧食生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治方法帶來了環(huán)境及食品的污染，效果也不能持久，而傳統(tǒng)的育種方式也很難滿足生產(chǎn)的需要。目前，利用基因工程手段培育抗蟲水稻品種成為解決這一問題的最主要手段之一。本研究旨在利用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciems），將來自蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis）上的crylAc和vip3A這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)化入水稻基因組，達(dá)到抗蟲效果。

3、 CrylAc蛋白是對小菜蛾、棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲有特異毒殺作用的殺蟲晶體蛋白，Vip3A蛋白則是具有較廣譜的殺蟲活性的營養(yǎng)期殺蟲蛋白，它們的抗蟲機(jī)理和抗蟲譜上存在協(xié)同作用。設(shè)計(jì)引物對vip3A—S/vip3A—A擴(kuò)增vip3A基因以及cry1Ac1—S/cry1Ac1—A和cry1Ac2—S/cry1Ac2—A這兩對引物擴(kuò)增cry1Ac基因的核心結(jié)構(gòu)域。將這兩個(gè)基因分別置于真核生物啟動子花椰菜葉病毒啟動子（CaMV35Spromoter

4、）和胭脂堿合酶基因終止子（Nosterminator）控制下，并克隆到雙元載體pCAMBIA1300中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBCAV，再將pBCAV轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105菌株。最后采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種臺北309（TP309）。轉(zhuǎn)化受體選用由TP309幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織。水稻TP309愈傷組織轉(zhuǎn)化后經(jīng)潮霉素篩選獲得了抗性愈傷組織，通過PCR驗(yàn)證，初步證明外源cry1Act和vip3A基因已經(jīng)成功的整合到受體組織中，得