適合轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻和棉花PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建及試用.pdf

1、在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以容易獲得、純度高、成本低和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展成為受歡迎的一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(替代品),更適合同時(shí)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)基因的檢測(cè)。為解決陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不容易獲得的困難,本研究構(gòu)建了適合常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因水稻和棉花產(chǎn)品PCR檢測(cè)的四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,以我國(guó)4個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系和16個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品種(品系)為研究材料,對(duì)其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的適用性進(jìn)行了初步驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建了適合于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻科豐6號(hào)品系特

2、異性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-KF6,建立了相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該質(zhì)粒全長(zhǎng)為3100 bp,通過(guò)在pMD18-T載體的克隆位點(diǎn)和HindⅢ酶切位點(diǎn)分別插入gos9序列和科豐6號(hào)5’端旁側(cè)序列構(gòu)建,為閉合環(huán)狀雙鏈DNA。建立了基于5’端旁側(cè)序列的科豐6號(hào)產(chǎn)品品系特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。5’旁側(cè)和gos9兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999和0.998,擴(kuò)增效率(E)分別為96.8％和97.2％,定量檢測(cè)限為10個(gè)

3、拷貝。對(duì)5％和1％兩個(gè)混合樣品進(jìn)行定量檢測(cè),評(píng)價(jià)和驗(yàn)證所建立的定量方法,結(jié)果顯示準(zhǔn)確性偏離率分別為4.0％和17.0％,精確性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為3.96％和3.42％。表明本研究建立的PCR定量檢測(cè)方法可以用于含有科豐6號(hào)轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的品系特異性定量檢測(cè),所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-KF6可以代替其基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用。
　　 2.構(gòu)建了適合于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻Bt汕優(yōu)63品系特異性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMDBt63,建立了

4、相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該質(zhì)粒全長(zhǎng)3137 bp,通過(guò)在pMD18-T載體的克隆位點(diǎn)和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)分別插入gos9序列和Bt汕優(yōu)633’端旁側(cè)序列構(gòu)建?；?’端旁側(cè)序列的Bt汕優(yōu)63產(chǎn)品品系特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.9997和0.9992,擴(kuò)增效率(E)分別為98.05％和99.46％。檢測(cè)限為10拷貝,定量限為100拷貝。應(yīng)用建立的方法對(duì)5％和1％兩個(gè)混合樣品進(jìn)行定量檢測(cè)結(jié)

5、果的準(zhǔn)確性偏離率(bias)分別為0.02和0.07,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為1.23％租5.61％。以上結(jié)果表明,本研究建立的PCR定量檢測(cè)方法可以用于含有Bt汕優(yōu)63轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的品系特異性定量檢測(cè),所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMDBt63可以代替其基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用。
　　 3.結(jié)合對(duì)多靶標(biāo)進(jìn)行PCR定量檢測(cè)的技術(shù)要求,探索構(gòu)建了適合于克螟稻等4個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻品系特異性檢測(cè)的多靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD68DH,建立了相應(yīng)的

6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該質(zhì)粒全長(zhǎng)為5152bp,通過(guò)在pMD18-T載體的克隆位點(diǎn)以及載體上的EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ3個(gè)酶切位點(diǎn)分別插入四個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻5’和3’端旁側(cè)序列以及水稻gos9、PLD和SPS三個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列構(gòu)建。為驗(yàn)證pMD68DH用于多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品定量檢測(cè)的適用性,以科豐8號(hào)和克螟稻水稻樣品DNA為檢測(cè)對(duì)象,選擇gos9基因作為定量的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因,分別建立了針對(duì)科豐8號(hào)和克螟稻2個(gè)抗蟲(chóng)水稻產(chǎn)品的品系特

7、異性定量PCR檢測(cè)方法。定量檢測(cè)限均為10拷貝。應(yīng)用所建立的PCR檢測(cè)方法分別對(duì)5％和1％兩個(gè)轉(zhuǎn)基因含量的科豐8號(hào)和克螟稻水稻樣品DNA進(jìn)行了定量檢測(cè)驗(yàn)證。科豐8號(hào)定量檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為21.6％和7.0％,精確性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.3％和7.48％。克螟稻定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.8％和1.0％,精確性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.29％和7.92％。以上結(jié)果表明,pMD68DH適合作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(替代品)用于有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)品的

8、PCR定量檢測(cè)。
　　 4.針對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉常用的主要轉(zhuǎn)基因元件和外源基因類型,結(jié)合對(duì)多靶標(biāo)對(duì)象進(jìn)行PCR定量檢測(cè)的技術(shù)要求,構(gòu)建了適合于我國(guó)目前轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花產(chǎn)品檢測(cè)的多靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMDMCS,建立了針對(duì)不同靶標(biāo)對(duì)象的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該質(zhì)粒全長(zhǎng)為4309 bp,在pMD20-T載體基礎(chǔ)上構(gòu)建,包括CaMV35S啟動(dòng)子、pNOS啟動(dòng)子、NOS終止子、7S終止子、nptⅡ標(biāo)記基因、CpT1抗蟲(chóng)基因和cry1A抗蟲(chóng)

9、基因等7個(gè)外源基因靶標(biāo)序列和棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Sad1基因序列。根據(jù)上述cry1A抗蟲(chóng)基因等轉(zhuǎn)基因檢測(cè)靶標(biāo)序列和Sad1棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)Χ喟袠?biāo)序列PCR定量檢測(cè)的技術(shù)要求,研究建立了針對(duì)不同靶標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。經(jīng)測(cè)試,所建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)均符合PCR定量檢測(cè)要求。以這些方法對(duì)我國(guó)16個(gè)抗蟲(chóng)棉品種(品系)樣品中7個(gè)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行了PCR定量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。定量結(jié)果表明,CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、7S終止子、nptⅡ標(biāo)記基