XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體系統(tǒng)的建立及其功能鑒定.pdf

1、目的：
　　 XJ-160病毒是1990年從我國(guó)新疆境內(nèi)捕獲的按蚊中分離到的一株病毒,經(jīng)鑒定為甲病毒屬辛德畢斯病毒(Sindbis virus,SINV)。目前本課題組已完成該病毒的全基因組序列測(cè)定,全基因組感染性cDNA克隆(pBR-XJ160)的構(gòu)建及RNA型復(fù)制子載體系統(tǒng)的建立。但RNA型復(fù)制子載體的啟動(dòng)子為原核啟動(dòng)子,應(yīng)用時(shí)需要進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,操作繁瑣。與其相比,質(zhì)粒型復(fù)制子載體可通過(guò)真核啟動(dòng)子(如CMV)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,無(wú)需體

2、外轉(zhuǎn)錄可直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高水平外源基因的表達(dá)。鑒于此,本研究擬在pBR-XJ160基礎(chǔ)上構(gòu)建XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體系統(tǒng),并對(duì)其進(jìn)行定性、定量的功能鑒定。
　　 方法：
　　 1.XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體pVa-XJ的構(gòu)建:以XJ-160病毒感染性全基因克隆pBR-XJ160為模板通過(guò)PCR將病毒非結(jié)構(gòu)基因序列分為三個(gè)片段擴(kuò)增:XJ1(1-2527nt),XJ2(2527-5161nt),XJ3(51

3、61-7562nt),采用分步克隆的方法將其依次克隆至真核表達(dá)載體pVAX1 CMV啟動(dòng)子下游,所用單一限制性內(nèi)切酶分別為:NheI/BamHI,BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI,并用多克隆位點(diǎn)(multiple clone sites,MCS)序列替代病毒的結(jié)構(gòu)基因,MCS由Nofl,PvuI,FseI,PaeI和AscI五種單一限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列構(gòu)成。
　　 2.輔助質(zhì)粒的構(gòu)建:輔助質(zhì)?？蔀閺?fù)制子載體反式提

4、供病毒結(jié)構(gòu)蛋白,以便包裝出復(fù)制缺陷型的病毒顆粒,并最終提高載體的包裝效率。因此,以感染性全基因克隆pBR-XJ160質(zhì)粒為基礎(chǔ)分別擴(kuò)增病毒核蛋白基因C(7563-8354nt)及包膜糖蛋白基因E(8355-11297nt)分別將其克隆至pVAX1 CMV啟動(dòng)子下游構(gòu)建載體的兩個(gè)輔助質(zhì)粒pVa-C和pVa-E,所用單一限制性內(nèi)切酶分別為:EcoRI/XhoI和BamHI/XhoI。
　　 3.復(fù)制子載體系統(tǒng)的功能鑒定:將綠色熒光蛋

5、白(Enhanced green fluorecentprotein,EGFP)報(bào)告基因及海腎熒光素酶(Gaussia Luciferase,GLUC)報(bào)告基因分別插入復(fù)制子載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建了含有報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC,所用單一限制性內(nèi)切酶分別為:NotI/AscI和FseI/AscI。將報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況及檢測(cè)海腎熒光素酶的活性以對(duì)復(fù)制子

6、載體系統(tǒng)進(jìn)行定性、定量的功能鑒定。
　　 結(jié)果
　　 1.構(gòu)建了XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體pVa-XJ,用引入的單一限制性內(nèi)切酶NotI,PvuI,FseI,PacI和AscI均可以將載體質(zhì)粒線性化,可獲得長(zhǎng)約10.5kb的線性載體片段;用NheI/BamHI,BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI雙酶切均可獲得長(zhǎng)度約為2.5kb和8kb的線性片段,基因測(cè)序結(jié)果也表明所構(gòu)建的載體序列正確。
　　 2.

7、構(gòu)建了XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體的兩個(gè)輔助質(zhì)粒pVa-C和pVa-E,用單一限制性內(nèi)切酶EcoRI/XhoI雙酶切質(zhì)粒pVa-C可得到長(zhǎng)約0.79kb的核蛋白基因片段和長(zhǎng)約3kb的線性pVAX1,用單一限制性內(nèi)切酶BamHI或XhoI單酶切質(zhì)粒pVa-E均可得到長(zhǎng)約6kb的線性pVa-E片段,基因測(cè)序結(jié)果也表明所構(gòu)建的輔助質(zhì)粒序列正確。
　　 3.對(duì)XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體系統(tǒng)進(jìn)行定性的功能鑒定,用單一限制性內(nèi)切酶

8、NotI/AscI雙酶切質(zhì)粒pVaXJ-EGFP可得到長(zhǎng)約0.7kb的EGFP基因片段和長(zhǎng)約10.5kb的線性pVa-XJ,測(cè)序鑒定結(jié)果也顯示我們成功構(gòu)建了綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒。將pVaXJ-EGFP及輔助質(zhì)粒pVa-C和pVa-E共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。
　　 4.對(duì)XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體系統(tǒng)進(jìn)行定量的功能鑒定,用單一限制性內(nèi)切酶FseI/AscI雙酶切質(zhì)粒pVaXJ-GLUC可

9、得到長(zhǎng)約0.59kb的GLUC基因片段和長(zhǎng)約10.5kb的線性pVa-XJ,測(cè)序鑒定結(jié)果也顯示我們成功構(gòu)建了海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒。將pVaXJ-GLtJC及輔助質(zhì)粒pVa-C和pVa-E共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后我們所構(gòu)建的復(fù)制子載體pVa-XJ所包裝的Gluc在BHK-21細(xì)胞中的活性開(kāi)始增強(qiáng),至30h達(dá)到最高值(7.8×104)。在轉(zhuǎn)染后30-48h載體所包裝的G.luc的活性顯著下降,48h時(shí)活性(3.0×104)。轉(zhuǎn)染