參與休克血管反應(yīng)性和鈣敏感性調(diào)控的PKC亞型及其MLC-,20-磷酸化調(diào)控機(jī)制.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管低反應(yīng)性，主要表現(xiàn)為全身血管對(duì)縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低或不反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，除了以往認(rèn)識(shí)的血管低反應(yīng)性發(fā)生的血管平滑肌細(xì)胞，的K+和Ca2+通道功能障礙、VSMC膜超極化之外，鈣失敏，即血管平滑肌細(xì)胞收縮蛋白對(duì)鈣的敏感性降低，也就是力/鈣比率和肌肉收縮效率的降低，也是休克血管低反應(yīng)性發(fā)生的重要原因；蛋白激酶C參與了休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性的調(diào)控。PKC是一組磷脂依賴性的鈣激活的蛋白絲氨

2、酸/蘇氨酸激酶，按生化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)可分為三大類：傳統(tǒng)型PKC：包括PKCα、βII、βI、γ；新型PKC：包括PKCδ、ε、η、θ；非典型PKC(atypical PKC，aPKC)：包括PKCζ、l、λ。在大鼠主動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈發(fā)現(xiàn)，主要表達(dá)PKCα、PKCδ、PKCε和PKCζ四種收縮功能相關(guān)亞型。但是哪些亞型參與失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性的調(diào)節(jié)，其機(jī)制如何?尚不清楚。據(jù)此，我們利用大鼠失血性休克模型和缺氧處理體外培養(yǎng)血管平滑

3、肌細(xì)胞模型，研究了參與失血性休克后鈣敏感性和血管反應(yīng)性調(diào)節(jié)的PKC亞型，并從MLC20磷酸化的非鈣依賴性調(diào)節(jié)途徑入手研究其機(jī)制，以及缺血預(yù)適應(yīng)和藥物預(yù)處理對(duì)其的誘導(dǎo)作用。主要內(nèi)容包括三部分：①明確參與失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的PKC亞型；②研究相關(guān)PKC亞型調(diào)節(jié)休克血管鈣敏感性的MLC20磷酸化機(jī)制；③觀察缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理對(duì)PKC的誘導(dǎo)作用及其對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用。 主要實(shí)驗(yàn)方法：

4、 第一部分明確參與失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的PKC亞型 1.采用失血性休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈的一級(jí)分支血管環(huán)，測(cè)定不同休克時(shí)間點(diǎn)(40 mmHg，即時(shí)、30min、1 h、2 h、4 h)血管環(huán)的血管反應(yīng)性(用血管環(huán)對(duì)梯度濃度NE的收縮反應(yīng)反映)和鈣敏感性(用血管環(huán)對(duì)梯度濃度鈣離子的收縮反應(yīng)反映)，觀察變化規(guī)律。 2.采用失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的腸系膜上動(dòng)脈的一級(jí)分支血管環(huán)，觀察各亞型

5、PKC的激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)休克2h血管反應(yīng)性、鈣敏感性的影響。 3.采用失血性休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈，測(cè)定休克不同時(shí)間點(diǎn)(40 mmHg，，即時(shí)、30min、1 h、2 h、4 h)相關(guān)亞型PKC的mRNA表達(dá)、在胞漿和胞膜的蛋白表達(dá)，觀察變化規(guī)律。 第二部分相關(guān)亞型PKC調(diào)控失血性休克大鼠血管鈣敏感性的MLC20磷酸化機(jī)制 1.采用失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的腸系膜上動(dòng)脈一級(jí)分支血管環(huán)，觀察CPI-1

6、7、ILK和ZIPK的拮抗劑(褪膜后應(yīng)用CPI-17、ILK和ZIPK的中和抗體)對(duì)相關(guān)亞型PKC激動(dòng)劑調(diào)節(jié)休克血管敏感性作用的影響，明確相關(guān)亞型PKC調(diào)控休克血管鈣敏感性是否與CPI-17、ILK和ZIPK有關(guān)。 2.采用缺氧培養(yǎng)的腸系膜上動(dòng)脈VSMC(缺氧處理2h，)，觀察相關(guān)亞型PKC激動(dòng)劑對(duì)缺氧后CPI-17磷酸化和表達(dá)、以及ILK、ZIPK的活性和表達(dá)的影響，明確相關(guān)亞型PKC究竟通過(guò)是影響CPI-17、ILK和ZIP

7、K的活性還是表達(dá)來(lái)調(diào)控鈣敏感性。 3.采用缺氧培養(yǎng)的腸系膜上動(dòng)脈VSMC(缺氧處理2h)，應(yīng)用免疫共沉淀和westernblot技術(shù)觀察缺氧2h后，以及相關(guān)亞型PKC激動(dòng)劑處理后，CPI-17、ILK、ZIPK和相關(guān)亞型PKC之間的相互作用關(guān)系，以及CPI-17、ILK和ZIPK之間的相互作用關(guān)系。 4.采用缺氧培養(yǎng)的腸系膜上動(dòng)脈VSMC(缺氧處理2h，)，觀察相關(guān)亞型PKC激動(dòng)劑及CPI-17、ILK和ZIPK抑制劑對(duì)

8、缺氧血管平滑肌細(xì)胞MLCP活性的影響；采用失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的腸系膜上動(dòng)脈，觀察相關(guān)亞型PKC激動(dòng)劑及CPI-17、ILK和ZIPK抑制劑對(duì)休克后血管MIC20磷酸化的影響，分析CPI-17、ILK和IPK調(diào)節(jié)休克后血管鈣敏感性與MLCP和MLC20的關(guān)系。 第三部分觀察缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理對(duì)PKC的誘導(dǎo)作用及其對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用 1.觀察不同失血量(2.5％、5％

9、、10％)預(yù)處理不同時(shí)間(30min、1h、2h、3h)后，以及不同劑量吡那地爾(12μg/kg體重、25μg/kg體重、50μg/kg體重)預(yù)處理不同時(shí)間(30min、1h、2h、3h)對(duì)失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的NE(3μg/kg體重)的升壓作用和縮血管作用的影響，以及對(duì)腸系膜上動(dòng)脈一級(jí)分支血管環(huán)的血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響，確定可誘導(dǎo)對(duì)失血性休克后血管反應(yīng)性保護(hù)作用的缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理?xiàng)l件。 2.觀

10、察相關(guān)亞型PKC拮抗劑對(duì)缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理(5％失血量以及25μg/kg體重吡那地爾預(yù)處理30min)誘導(dǎo)的對(duì)失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)血管反應(yīng)性和鈣敏感性保護(hù)作用的影響。以及觀察缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)腸系膜上動(dòng)脈相關(guān)亞型PKC胞漿和胞膜蛋白表達(dá)的影響。 主要結(jié)果： 一、參與失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的PKC亞型 1.失血性休克后大鼠腸

11、系膜上動(dòng)脈對(duì)NE和Ca2+的收縮反應(yīng)性在休克早期增高(P<0.01)，從休克30min開(kāi)始降低(P<0.01)，并隨著休克時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低(P<0.01)。 2.PKCα激動(dòng)劑thymelea toxin、PKCe激動(dòng)劑carbachol和PKCδ的非特異性激動(dòng)劑PMA可顯著增高休克2h大鼠腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE和Ca2+的收縮反應(yīng)性(P<0.01)，PKCα抑制劑Go-6976和PKCe假底物抑制肽可顯著降低休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈對(duì)

12、NE和Ca2+的收縮反應(yīng)性(P<0.01)，但PKCζ的激動(dòng)劑和抑制劑不改變休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE和Ca2+的收縮反應(yīng)性，PKCδ的抑制劑不能抑制PMA的增高休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE和Ca2+收縮反應(yīng)性的作用。 3.PKCα和PKCε的mRNA表達(dá)在失血性休克后逐漸增高(P<0.01)。失血性休克后，PKCα和PKCε在胞漿部分的蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，而在胞膜部分的蛋白表達(dá)增高(P<0.01)，呈現(xiàn)由胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)

13、位。 二、相關(guān)亞型PKC調(diào)控失血性休克大鼠血管鈣敏感性的MLC20磷酸化機(jī)制 1.PKCα激動(dòng)劑thymelea toxin和PKCε激動(dòng)劑carbachol可部分恢復(fù)休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈的鈣敏感性(P<0.01)，CPI-17、ILK和ZIPK的中和抗體可消除PKCα和ε激動(dòng)劑對(duì)休克血管鈣敏感性的恢復(fù)作用(P<0.01)。 2.缺氧2h的VSMC中CPI-17、ILK和ZIPK的蛋白表達(dá)、CPI-17磷酸化、I

14、LK和ZIPK活性均降低(P<0.01)，PKCα激動(dòng)劑thymelea toxin和PKCe激動(dòng)劑carbachol可增高其蛋白表達(dá)，增高CPI-17磷酸化、以及ILK和ZIPK活性(P<0.01)。 3.PKCα的免疫沉淀中可雜交出ILK和ZIPK，尤其是ILK的蛋白條帶，不能雜交出CPI-17的蛋白條帶，PKCe的免疫沉淀中可雜交出ILK和ZIPK的蛋白條帶，也不能雜交出CPI-17的蛋白條帶，CPI-17的免疫沉淀中可雜

15、交出ILK和ZIPK的蛋白條帶，ILK的免疫沉淀中可雜交出ZIPK的蛋白條帶。 4.缺氧2h的VSMC中，MLCP活性顯著增高(P<0.01)，休克2h的大鼠腸系膜上動(dòng)脈中MLC20磷酸化顯著降低(P<0.01)，PKCα和PKCε激動(dòng)劑可降低缺氧后的MLCP活性(P<0.01)，增高休克后的MLC20磷酸化(P<0.01)，CPI-17、ILK和ZIPK的中和抗體可逆轉(zhuǎn)PKCα和PKCε激動(dòng)劑對(duì)缺氧后MLCP活性和MLC20磷

16、酸化的作用(P<0.01)。 三、缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理對(duì)PKC的誘導(dǎo)作用及其對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用 1.缺血預(yù)處理和吡那地爾預(yù)處理可改善失血性休克2h后NE誘導(dǎo)的升壓效應(yīng)和縮血管效應(yīng)，改善SMA的血管反應(yīng)性和鈣敏感性，以5％失血量預(yù)適應(yīng)30min和25μg/kg吡那地爾預(yù)處理30min效果最好(P<0.01)。 2.PKCα抑制劑Go-6976和PKCε假底物抑制肽可顯著抑制缺血預(yù)適

17、應(yīng)(5％失血量預(yù)適應(yīng)30min)和吡那地爾預(yù)處理(25μg/kg吡那地爾預(yù)處理30min)誘導(dǎo)的對(duì)失血性休克2h后SMA一級(jí)分支血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用(P<0.01)。缺血預(yù)適應(yīng)和吡那地爾預(yù)處理可誘導(dǎo)失血性休克后的PKCα和PKCε由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位(P<0.01)。 結(jié)論： 1.PKCα和PKCε是參與大鼠失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的主要PKC亞型，也是失血性休克后血管反應(yīng)性的重要內(nèi)源性保護(hù)分子。