缺氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)休克血管反應(yīng)性的調(diào)控作用及其機(jī)制.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、膿毒癥病人在經(jīng)歷缺血缺氧、再灌注損傷以及腸道菌群移位、內(nèi)毒素釋放等的“多重打擊”后，常常在失代償期出現(xiàn)不可逆的組織細(xì)胞損傷，出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)乃至多器官功能衰竭(MOF)。究其原因，除了全身炎癥失控外，休克后血管反應(yīng)性降低是另一重要原因。血管低反應(yīng)性表現(xiàn)為全身血管對(duì)縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低或反應(yīng)麻痹，導(dǎo)致血壓不能有效提升、組織灌注難以改善，細(xì)胞缺氧和損傷進(jìn)行性加重。

2、因此，血管低反應(yīng)性的發(fā)生一方面影響休克的發(fā)生和發(fā)展，另一方面嚴(yán)重地影響著創(chuàng)傷/休克的治療和轉(zhuǎn)歸。研究發(fā)現(xiàn)血管低反應(yīng)性的發(fā)生與腎上腺素能受體失敏、血管平滑肌細(xì)胞(VSMc)鉀、鈣通道功能失常及細(xì)胞膜超極化有關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)Rho激酶可通過(guò)調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的活性和肌球蛋白輕鏈(MLC20)磷酸化水平及鈣敏感性變化參與休克后血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。 HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)性

3、反應(yīng)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的一個(gè)在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮特異性活性的調(diào)節(jié)分子，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵分子，它同激活蛋白(activated protein 1，AP-1)，核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factorkB，NF-kB)和p53等協(xié)同作用調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)缺氧的反應(yīng)，其功能涉及能量代謝、細(xì)胞增殖、造血作用、血管形成、重塑與收縮等諸多方面。 缺血缺氧是各種類型休克的最基本的病理生理變化，故HIF-1α應(yīng)該是休克后表達(dá)和活性變

4、化最顯著的分子之一。大量研究表明：失血性休克后期可激發(fā)明顯的失控性系統(tǒng)炎癥和缺血再灌注損傷，HIF-1α通過(guò)多種途徑參與了上述兩種損傷效應(yīng)的形成和發(fā)展。而有關(guān)HIF-1α與血管舒縮活性及反應(yīng)性的相關(guān)研究目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。由此，本實(shí)驗(yàn)選擇缺氧誘導(dǎo)因子1 α(HIF-1α及其一系列下游分子作為研究靶點(diǎn)，以HIF-1 α特異性阻斷劑寡霉素為工具藥，探討HIF-1 α對(duì)休克血管反應(yīng)性的調(diào)控作用。具體內(nèi)容包括兩大部分：(1)HIF-1α在失血性休

5、克后血管反應(yīng)性變化中的調(diào)節(jié)作用；(2)失血性休克后HIF-1α調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性的機(jī)制。 主要實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分觀察HIF-1α在失血性休克后血管反應(yīng)性變化中的調(diào)節(jié)作用，包括：建立大鼠重癥失血性休克模型，制備腸系膜上動(dòng)脈(SMA)血管環(huán)，利用離體血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)，觀察休克后不同時(shí)相點(diǎn)(休克0.5h，休克1.0h，休克2.0h，休克3.0h，休克4.0h，休克6.0h)SMA對(duì)梯度濃度去甲腎上腺素(NE)的收縮反應(yīng)性。同時(shí)

6、取腸系膜動(dòng)脈，利用RT-PCR技術(shù)分析測(cè)定休克后各時(shí)相點(diǎn)HIF-1α mRNA表達(dá)變化。同時(shí)利用以HIF-1α特異性阻斷劑寡霉素為工具藥，觀察給藥后休克各時(shí)相點(diǎn)血管環(huán)張力和HIF-1αmRNA表達(dá)變化，進(jìn)而分析HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)休克血管反應(yīng)性的影響。 第二部分，通過(guò)在體和離體實(shí)驗(yàn)，探討失血性休克后HIF-1α調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性的機(jī)制。在體實(shí)驗(yàn)：取大鼠失血性休克SMA組織，RT-PCR觀察休克后eNOS、iNOS、HO-1、C

7、OX-2mRNA時(shí)相表達(dá)變化，同時(shí)分別采用連二亞硫酸鈉(Na<,2>S<,2>O<,4>)還原法、硝酸還原酶法和放射免疫技術(shù)(RIA)測(cè)定休克后各時(shí)相血NO、CO、PGI含量變化，進(jìn)而分析失血性休克后HIF-1α對(duì)eNOS/iNOS-NO、HO-1-CO和COX-2-PGI通路的影響。離體實(shí)驗(yàn)：利用Transwell培養(yǎng)小室缺氧共培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞(VsMC)和內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)，測(cè)定Teanswell下腔熒光滲透率反映VSMC對(duì)去甲腎

8、上腺素(NE)的收縮反應(yīng)性；同時(shí)利用RT-PCR半定量分析HIF-1α及其相關(guān)分子的mRNA表達(dá)變化規(guī)律：內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、血紅素氧合酶-1(HO-1)，進(jìn)一步分析缺氧后VSMC收縮反應(yīng)的影響與上述分子的影響的關(guān)系。 主要研究結(jié)果： 1．失血性休克后HIF-1α mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并于4h出現(xiàn)表達(dá)峰值(P<0.01)。血管反應(yīng)性呈現(xiàn)雙相變化，即

9、早期(0.0h-1.0h)血管反應(yīng)性增高，量一效曲線左移、最大收縮力(Emax)顯著性增大和pD<,2>減小(P<0.01)。至休克中、后期，血管反應(yīng)性進(jìn)行性下降，表現(xiàn)為量一效曲線右移、Emax降低和pD2增大，至休克后4h血管反應(yīng)性即低于正常水平(P<0.01)。休克后給藥組血管反應(yīng)性亦呈現(xiàn)雙相變化，但其幅度明顯降低。表現(xiàn)為在早期(0.5-1.0h)血管反應(yīng)性的抬高趨勢(shì)被部分抑制(P<0.01)，至休克晚期(4.0-6.0h)可使血管

10、反應(yīng)性得以輕度回升(P<0.05或P<0.01)。 2．失血性休克后eNOS、iNOS、HO-1、COX-2 mRNA表達(dá)均隨時(shí)相的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，分別于1.0h、2.0h、3.0h和4.0h到達(dá)高峰(P<0.05或P<0.01)。給藥組eNOS、HO-1、COX-2：mRNA表達(dá)量基本波動(dòng)于正常范圍。而iNoS則表現(xiàn)為休克早、中期(1.0h-3.0h)表達(dá)受抑制，而在晚期(4.0h-6.0h)較休克同時(shí)相有顯著增加(P<0.0

11、1)。 3．血漿NO、PGI和全血CO濃度均隨著休克時(shí)相進(jìn)展而顯著升高(P<0.05或P<0.01)。HIF-1α特異性阻斷劑寡霉素可使CO則穩(wěn)定于正常水平，而NO和PGI表達(dá)被部分抑制，隨著休克時(shí)相的延長(zhǎng)有增高趨勢(shì)，但其幅度顯著低于休克同時(shí)相組(P<0.011。 4．缺氧后VSMC收縮反應(yīng)性呈現(xiàn)雙相變化，即缺氧早期(0.0-1.0h)VSMC收縮反應(yīng)性顯著性增高且于0.5h達(dá)到峰值(P<0.01)。至缺氧后期(4.0-

12、6.0h)VSMC收縮反應(yīng)性進(jìn)行性下降，至4h血管反應(yīng)性即低于正常水平，至6h僅為正常對(duì)照的70％(P<0.05)。給藥組則表現(xiàn)為缺氧后早期反應(yīng)性的增高趨勢(shì)被完全抑制(P<0.05或P<0.01)，而4.0h-6.0h VSMC的收縮反應(yīng)性可有部分提高(P<0.05)。 5．vSMC+vEC混合培養(yǎng)后，隨著缺氧時(shí)相的延長(zhǎng)，HIF-1α、iNOS、HO-1、COX-2mRNA表達(dá)均逐漸增強(qiáng)，分別于4.0h、2.0h、3.0h和4.

13、0h到達(dá)高峰(P<0.01或P<0.05)。給藥組各時(shí)相表現(xiàn)為上述mRNA表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)被完全抑制，基本均波動(dòng)于正常范圍內(nèi)。eNOS mRNA表達(dá)受缺氧和給藥處理方式的影響輕微，缺氧組和給藥組各時(shí)相表達(dá)量與正常對(duì)照擁比均無(wú)顯著變化。 結(jié)論： 1．失血性休克后大鼠SMA收縮反應(yīng)呈雙相變化，即休克早期血管反應(yīng)性增高，晚期血管反應(yīng)性降低。HIF-1αmRNA表達(dá)隨休克時(shí)相進(jìn)展逐漸上調(diào)，至晚期進(jìn)行性下降。HIF-1α阻斷劑寡霉素處

14、理可對(duì)休克后血管反應(yīng)性的雙相變化產(chǎn)生雙相調(diào)節(jié)作用：在早期0.5-1h可部分抑制血管反應(yīng)性的抬高趨勢(shì)，至休克晚期可使血管反應(yīng)性得以輕度回升。HIF-1α在失血性休克大鼠血管收縮反應(yīng)性的雙相變化的形成中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用：其轉(zhuǎn)錄水平在休克早期的輕度上調(diào)與血管收縮反應(yīng)性呈正相關(guān)，至休克晚期則呈負(fù)相關(guān)。 2．休克后eNOS、iNOS、HO-1和COX-2 mRNA表達(dá)依次激活、上調(diào)并達(dá)峰值，在阻斷HIF-1α表達(dá)后其轉(zhuǎn)錄水平亦不同程度

15、地受到明顯抑制。HIF-1 α調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性的途徑包括eNOS/iNOS-NO、HO-1-CO、COX-2-PGI等通路，通過(guò)影響具有血管舒縮功能調(diào)節(jié)作用分子的基因表達(dá)，從而引起血管舒縮活性物質(zhì)的生成和釋放的相應(yīng)變化：HS早期HIF-1α及其下游分子代償性增加，其輕度表達(dá)有利于血管反應(yīng)性的適應(yīng)性保護(hù)，為正相關(guān)因素。至休克失代償期轉(zhuǎn)化為負(fù)相關(guān)：即HIF-1α過(guò)度激活、表達(dá)并蓄積，引起NO、CO、PGI等血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生失調(diào)、釋放失控和作