激活溫度敏感性瞬時受體電位通道調控血管功能和血壓的機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　瞬時受體電位(transient receptor potentials,TRPs)通道是細胞質膜上的非選擇性陽離子通道,其部分亞型因對溫度敏感被稱為溫度敏感性TRP通道(thermo-TRPs)。溫度敏感性TRP通道共有10個成員,分別是TRPA1、C5、M2、M4、M5、M8、V1、V2、V3和V4,因激活溫度不同分為傷害熱感受器、溫和溫度激活T RP和冷感受器。T RP V1和TRP V2是傷害熱感受器,冷

2、感受器包括TRPA1和TRP M8,其他的為溫和溫度激活T RP。溫度敏感性T RP通道分布于初級感覺神經元,感受環(huán)境溫度變化,并將溫度信息以電生理信號形式傳遞至神經中樞,興奮交感神經,引起外周血管的收縮或舒張,增加產熱或促進散熱。這些通道表達和功能異常,會導致機體溫度感覺超敏或失敏。溫度敏感性T RP不僅分布于神經組織被溫度變化所激活,還廣泛地分布于血管組織,被滲透壓變化、牽張力改變、天然或合成的化合物以及內源性配體激活物,參與調節(jié)血

3、管的生理功能。血管功能異常,包括血管張力調節(jié)、內皮依賴性血管舒張功能異常、內皮高通透性、平滑肌細胞增殖和遷移,以及對炎癥介質、氧化應激、血管活性物質的高反應性,促進高血壓、冠狀動脈硬化心臟病、卒中等心腦血管發(fā)生和發(fā)展。目前心腦血管疾病仍是威脅人類健康的首要疾病,改善血管功能是疾病早期有效控制疾病進展的必然途經。由于鈣離子代謝對調節(jié)血管內皮細胞(ECs)和血管平滑肌細胞(VS MCs)功能具有重要作用,而大多數(shù)溫度敏感性TRP通道都對鈣離

4、子具有通透性,這為我們預防和治療血管相關疾病展開了新的視野。
　　TRPM8在血管組織主要表達于 VSMC s,薄荷醇激活 TRP M8可以引起鈣離子內流,但發(fā)現(xiàn)薄荷醇激活大鼠尾動脈 TRPM8卻抑制縮血管物質誘導的動脈血管收縮,表現(xiàn)為短暫的血管收縮后出現(xiàn)持續(xù)的舒張,但其機制目前仍無統(tǒng)一定論。有研究認為是抑制了電壓門控通道誘導的鈣內流所致,但肌細胞的持續(xù)收縮有賴于鈣庫操控鈣通道和持續(xù)的小量鈣內流以保證胞內游離鈣離子水平,同時需要R

5、ho激酶通路參與的肌細胞鈣敏化作用參與。低溫激活TRP M8誘導胃底平滑肌收縮,其中便有 Rho激酶通路參與調節(jié)平滑肌收縮作用,說明 TRPM8與 Rho激酶通路之間存在一定聯(lián)系。但薄荷醇卻并未如同低溫引起平滑肌收縮,臨床上常用薄荷成份來緩解腸道平滑肌痙攣。研究發(fā)現(xiàn)人前臂局部涂擦 TRP M8激動劑薄荷醇引起血管擴張,盡管血壓變化無顯著差異,但平均動脈壓表現(xiàn)為下降趨勢?；诖?我們假設薄荷醇激活 TRPM8后干擾RhoA/ROCK通路的

6、鈣敏化作用,并影響鈣庫操控鈣通道功能,抑制血管收縮,并具有降低血壓作用。
　　另一種研究廣泛的溫度敏感性 TRP亞型 TRP V1,在血管組織主要表達于 ECs、VSMC s和管周感覺神經,已經明確其通過多種途經參與調節(jié)血管舒縮功能,長期激活TRPV1對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)具有降壓作用。但在合并其他危險因素條件下,特別是糖尿病合并血管病變時,其是否仍有保護作用尚不清楚。糖尿病是心血管疾病的獨立危險因素,高血糖主要通過增加血管

7、內皮細胞氧化應激狀態(tài)對血管內皮功能造成損傷,增加的活性氧簇(ROS)降低內皮型一氧化氮合酶(eNOS)生物活性,減少 NO生成。線粒體是 ROS的主要來源之一,表達于線粒體的解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是 ROS生成的生理條件因子,其主要受環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶 A(PK A)調節(jié)。前期研究發(fā)現(xiàn)激活TRPV1,可以激活 Ca2+敏感的 PKA調節(jié) eNOS活性,辣椒素也可以增加肝臟和脂肪組織UCP2表達。因此,我們提出糖尿病病理狀態(tài)下,長期激

8、活TRP V1可以通過PK A途經上調線粒體UCP2表達,減少ROS產生,增加eNOS活性,促進NO生成,并緩解高糖所致血管功能紊亂。
　　本研究分為兩部分進行。第一部分探討激活冷感受器TRP M8通道對于血管功能的影響及其機制。分題一,TRPM8在血管平滑肌細胞的表達情況;分題二,長期薄荷醇飼食激活TRPM8對動物血管舒張功能和血壓的影響;分題三,激活TRPM8對平滑肌細胞RhoA/ROCK通路蛋白表達影響,對肌細胞收縮時相影響

9、,不同調節(jié)肌細胞膜鈣通道制劑對細胞內鈣離子水平的影響;分題四,觀察口服薄荷醇對高血壓前期受試者血管功能和血壓的影響。第二部分探討激活熱感受器T RP V1通道對糖尿病病理狀態(tài)下血管功能的影響及其機制,檢測長期辣椒素飼食激活TPRV1對糖尿病小鼠血管和血壓的影響,對內皮細胞NO生成相關蛋白水平的影響,以及血管內膜ROS和NO的生成影響。
　　材料和方法:
　　整個研究由離體實驗、在體實驗和臨床試驗三部分組成。離體實驗以培養(yǎng)動物

10、的胸主動脈內皮細胞以及腸系膜動脈為研究對象。在體試驗采用了多種動物模型:包括C57/BL6J野生型(WT)和TRPM8基因敲除(TRPM8-/-)小鼠、SHR模型,分為薄荷醇組(含0.5％薄荷醇飼料)和對照組(普通飼料),飲食干預28周;C57BL/KsJ野生型小鼠和糖尿病小鼠(db/db)模型,分為辣椒素組(含0.01%辣椒素飼料)和對照組(普通飼料),飲食干預14周。臨床試驗以高血壓前期受試者為研究對象,隨機分配至薄荷醇組和安慰劑組

11、,進行為期8周的隨機、雙盲、安慰劑對照干預試驗。
　　1.采用RT-PCR、蛋白免疫印跡、免疫熒光染色等分子生物學技術,檢測 TRPM8在小鼠主動脈組織和腸系膜動脈平滑肌細胞表達情況。
　　2.采用小血管張力測定技術檢測薄荷醇急性刺激后小鼠腸系膜動脈舒縮功能,以及薄荷醇或辣椒素長期膳食干預的WT小鼠、TRPM8-/-小鼠、SHR、d b/d b小鼠等動物模型的腸系膜動脈或主動脈血管舒縮功能情況。
　　3.采用無線遙測信

12、號系統(tǒng)檢測薄荷醇干預后清醒狀態(tài)下WT小鼠、TRPM8-/-小鼠、SHR動態(tài)血壓情況;采用鼠尾測壓方法檢測清醒狀態(tài)下SHR薄荷醇干預后鼠尾血壓,以及小db/db鼠辣椒素干預后鼠尾血壓情況。
　　4.采用蛋白免疫印跡技術檢測薄荷醇急性刺激或長期干預后小鼠和 SHR腸系膜動脈 RhoA/ROCK信號通路蛋白表達情況;C57BL/KsJ野生型小鼠和db/db小鼠辣長期椒素干預后主動脈和腸系膜動脈 T RP V1和 N O產生相關信號通路蛋

13、白(phospho-PKA、UCP2、p22phox、eNOS)。
　　5.采用比率熒光成像系統(tǒng)檢測薄荷醇刺激后血管平滑肌細胞內游離鈣離子([Ca2+]i)情況。
　　6.采用熒光顯像技術檢測長期辣椒素干預后d b/d b小鼠腸系膜動脈內膜面的超氧陰離子水平和NO水平。
　　7.采用水銀柱血壓檢測方法測量臨床高血壓前期受試者薄荷醇干預期間診室血壓;采用動態(tài)血壓檢測技術檢查薄荷醇干預前后動態(tài)血壓。
　　8.采用血管

14、超聲技術檢測薄荷醇干預前后臨床高血壓前期受試者血管舒張功能,包括血流介導的血管舒張和硝酸甘油誘導的血管功能。
　　結果:
　　1. TRPM8在小鼠主動脈和腸系膜動脈血管平滑肌細胞均有表達。
　　2.長期薄荷醇膳食干預激活TRPM8后,降低野生型小鼠和SHR腸系膜動脈對縮血管物質血栓烷A2類似物U46619的反應,并降低野生型小鼠和SHR的動態(tài)血壓、鼠尾血壓,而對TRPM8-/-小鼠均無效。
　　3.急性激活TR

15、PM8或應用ROCK抑制劑Y27632均抑制U46619刺激下的腸系膜動脈VSMCs RhoA/ROCK通路蛋白表達增加,薄荷醇長期激活TRPM8均減弱野生型小鼠和SHR腸系膜動脈VSMCs RhoA/ROCK通路蛋白表達,但對TRPM8-/-小鼠無效。
　　4.薄荷醇急性激活TRP M8的呈濃度依賴性抑制U46619誘導的血管收縮,以抑制肌細胞收縮持續(xù)相為主,內皮剝脫影響不明顯,可以被TRP M8基因敲除或TRP M8抑制劑阻斷

16、,但TRPM8基因敲除對Y27632的抑制血管收縮作用無影響;薄荷醇抑制U46619誘導的鈣庫操控性鈣通道,TRPM8基因敲除抑制作用消失。
　　5.長期薄荷醇膠囊口服治療改善高血壓前期受試者內皮依賴性和非依賴性血管舒張功能,并降低血壓。
　　6.長期辣椒素膳食干預增加糖尿病小鼠腸系膜動脈TRP V1表達、PK A磷酸化水平、UPC2表達,降低p22phox水平和血管內膜ROS生成水平,增加eNOS磷酸化和NO生成。

17、　　7.長期辣椒素膳食干預改善糖尿病小鼠腸系膜動脈血管舒縮功能,但對血壓影響無顯著差異。
　　結論:
　　1.薄荷醇激活TRPM8抑制縮血管物質引起的鈣庫鈣釋放,抑制RhoA/ROCK通路調節(jié)的血管平滑肌細胞鈣敏化作用,減弱肌細胞瞬時相和持續(xù)相收縮,改善阻力血管張力,長期激活TRP M8降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓。
　　2.長期口服薄荷醇膠囊有助于高血壓受試者血管功能改善和血壓降低。
　　3.辣椒素激活TRPV1促