中國(guó)人種慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F突變頻度、磷酸化JAK-STAT蛋白表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、慢性骨髓增殖性疾病(Chronic myeloploliferative disorders，CMPDs)是一種克隆性造血干細(xì)胞疾病，以骨髓中一系或多系細(xì)胞過(guò)度活化和外周血中成熟細(xì)胞數(shù)量增多為特征。WHO認(rèn)定的CMPDs包括[1]：慢性粒細(xì)胞性白血病(Chronic myelogenousleukemia，CML)、慢性嗜中性粒細(xì)胞性白血病(Chrinic neutrophileleukemia，CNL)、慢性嗜酸性粒細(xì)胞性白血病(和高

2、嗜酸性粒細(xì)胞綜合癥)[Chronic eosinophilic leukemia(and the hypereosinophicsyndrome)，CEL/HES]、真性紅細(xì)胞增多癥(Polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥(Essential thrombocythemia，ET)、慢性特發(fā)性骨髓纖維化(伴髓外造血)[Chronic idiopathic myelofibrosis(withextramedull

3、ary hematopoiesis)，CIMF]、未分型的慢性骨髓增殖性疾病(Chronic myeloproliferative disease，unclassifiable，UCMPD)。 盡管WHO對(duì)MPDs亞型有嚴(yán)格的的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于精確的分類仍有困難[2]，在某些情況下很難與反應(yīng)性骨髓增生相鑒別。只有CML存在特異性的分子生物學(xué)標(biāo)記BCR-ABL融合基因，并認(rèn)為該融合基因是CML慢性期一個(gè)原發(fā)的、也可能是唯一的發(fā)病因

4、素[3]。 近二年國(guó)外的研究結(jié)果表明，在絕大多數(shù)的PV，以及將近半數(shù)的ET或IMF患者中存在JAK2V617F基因突變[4-7]，這種發(fā)生在JAK2假激酶區(qū)(pseudokinase domain)(具有自身抑制活性的高度保守區(qū)域)的突變，可導(dǎo)致JAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑持續(xù)活化[8-9]，而JAK2的自身激活可使其下游的的信號(hào)轉(zhuǎn)錄傳導(dǎo)和激活因子(signal transducerand activator of transcripti

5、on，STAT)磷酸化[10]，磷酸化的STAT5轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與DNA-STAT5結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而促使細(xì)胞增殖基因的轉(zhuǎn)錄[11]，使得髓系造血祖細(xì)胞對(duì)各種生長(zhǎng)因子及其受體高度敏感。 本課題以38例PV，12例ET，14例CIMF，20例CML，1例CNL和5例UCMPD為研究對(duì)象，使用PCR產(chǎn)物測(cè)序及等位基因特異性PCR方法測(cè)定各型MPDS患者JAK2V617F突變，并對(duì)磷酸化JAK/STATs信號(hào)蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究觀察，以進(jìn)

6、一步揭示CMPD發(fā)病的分子機(jī)理，結(jié)合JAK2 V617F突變存在與否并綜合觀察、分析相應(yīng)的骨髓增殖性疾病患者的臨床特點(diǎn)，探討JAK2 V617F突變對(duì)MPDS診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷中的價(jià)值和意義。 第一部分慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F突變鑒定 目的：獲得中國(guó)人種骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突變發(fā)生的百分率；比較DNA序列測(cè)定和等位基因特異性PCR測(cè)定在檢測(cè)JAK2V617F突變的敏感性和特異性，確定一種

7、簡(jiǎn)單可靠的基因突變檢測(cè)方法。 方法：所有病例均常規(guī)抽取外周血5至10ml，分離中性粒細(xì)胞，用酚氯法抽提基因組DNA，并用前向引物5'-TCCTCAGAACGTTGATGGCAG-3’和反向引物5'-ATrGCTITC-CTTTTTCACAAGAT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行堿基序列測(cè)定。同時(shí)應(yīng)用兩條前向引物(內(nèi)參照前向引物：5’-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3’和特異性前向

8、引物：5’-AGCATTTGGTTTYAAATYATGGAGTATATY-3’)和一條共同的反向引物：(5’-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTFCAGTTTCA-3’)進(jìn)行等位基因特異性PCR，將等位基因特異PCR結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，從而確定等位基因特異PCR在JAK2V617F突變檢測(cè)中的敏感性和特異性。 結(jié)果：在90例慢性骨髓增殖性疾病患者用常規(guī)的PCR產(chǎn)物測(cè)序方法檢測(cè)到43例突變(38例真性紅細(xì)胞增多癥

9、中有32例突變，突變率為84.2％；14例慢性骨髓纖維化患者中有6例突變，突變率為42.8％；12例原發(fā)性血小板增多癥患者中有5例突變，突變率為41.7％，20例慢性粒細(xì)胞白血病中無(wú)1例突變，突變率為0％；5例未定型的慢性骨髓增殖性疾病和1例慢性嗜中性粒細(xì)胞白血病中未發(fā)現(xiàn)有突變)。采用等位基因特異性PCR方法則檢測(cè)出有49例MPDS患者存在JAK2V617F突變，該突變并經(jīng)過(guò)正反測(cè)序得到進(jìn)一步確定。 結(jié)論：中國(guó)人種的慢性骨髓增殖

10、性疾病患也存在JAK2V617F突變，該突變見(jiàn)于絕大多數(shù)Pv患者和將近半數(shù)的ET和CMIF患者，突變的發(fā)生率與西方人種近似；等位基因特異性PCR檢測(cè)JAK2V617F突變較PCR產(chǎn)物直接測(cè)序具有更高的敏感性和陽(yáng)性檢測(cè)率，值得在臨床上推廣應(yīng)用。 第二部分 JAK2、磷酸化的JAK2和STAT5在JAK2 V617F突變的MPDS外周血粒細(xì)胞的表達(dá)分析 目的：為進(jìn)一步揭示具有JAK2 V617F突變的CMPDs的分子發(fā)病機(jī)理

11、。我們比較了JAK2V617F突變陽(yáng)性和JAK2V617F突變陰性的CMPDs患者外周血粒細(xì)胞中JAK2蛋白、磷酸化JAK2及磷酸化STAT5蛋白的表達(dá)，觀察是否JAK2 V617F突變啟動(dòng)或激活了JAK/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法：抽取49例JAK2V617F突變陽(yáng)性CMPDS患者和41例JAK2V617F突變陰性的CMPDs患者的肝素抗凝外周血5-10ml，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用Western印跡技術(shù)分別

12、檢測(cè)其JAK2及磷酸化JAK2、磷酸化STAT5蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：具有JAK2V617F突變的MPDS患者JAK2蛋白的表達(dá)水平與JAK2V617F突變陰性的MPDS患者無(wú)顯著性差異；但磷酸化的JAK2及磷酸化的STAT5蛋白表達(dá)在JAK2V617F突變陽(yáng)性的MPDS患者較JAK2 V617F突變陰性的MPDS組顯著性增高(P<0.05)。 結(jié)論：JAK2V617F突變陽(yáng)性的CMPDs患者存在磷酸化JAK2/STAT

13、5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，這一活化可能使得JAK2發(fā)生自身激活并促使JAK2/STAT5磷酸化，從而傳遞細(xì)胞增殖信號(hào)。 第三部分具有JAK2V617F突變陽(yáng)性的骨髓增殖性疾病患者的臨床特點(diǎn)及意義分析 目的：比較分析49例具有JAK2V617F突變陽(yáng)性和15例JAK2V617F突變陰性的的CMPDs的臨床特點(diǎn)，分析JAK2V617F突變對(duì)MPDS診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷的意義。 方法：按WHO診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分

14、型，常規(guī)行JAK2 V617F突變的檢測(cè)，并回顧性調(diào)查記錄初診時(shí)患者的外周血血細(xì)胞計(jì)數(shù)，B超檢查的脾臟大小，皮膚瘙癢癥狀以及血栓性事件的發(fā)生率。 結(jié)果：JAK2V617F突變陽(yáng)性的MPDS患者發(fā)病時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)與JAK2V617F突變陰性的MPDS患者無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但JAK2V617F突變陽(yáng)性患者發(fā)病時(shí)血紅蛋白增高明顯，脾臟腫大更顯著，且發(fā)病的年齡偏大，發(fā)生血栓性事件概率增加，而JAK2V617F突變陰性的MPD