伯基特淋巴瘤中JAK2磷酸化TOPK的作用機制及中國人熱點基因突變的研究.pdf

1、背景:
　　伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）是一種侵襲性極高的B細胞非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)生在4-7歲的兒童，男女比例約為2:1。腫瘤細胞常出現(xiàn)特征性的MYC基因轉位及EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染。大部分患者經(jīng)過一線治療方案治療后效果良好，但血清乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）明顯升高、出現(xiàn)并發(fā)癥及發(fā)現(xiàn)時已是晚期的患者療效較差。對于難治性BL尚

2、無很好的治療方案，因此亟需對其高增殖等特點的分子機制進行深入研究，以尋找新的治療靶點及方案。早在1994年就有研究者在BL中檢測到了高表達的T-LAK細胞起源的蛋白激酶（T-LAK cells originated protein kinase，TOPK），這是一種與腫瘤細胞周期、增殖、轉移及凋亡密切相關的蛋白激酶。但目前TOPK在BL中的研究僅局限在發(fā)現(xiàn)其高表達的現(xiàn)象，至于TOPK在BL中高表達的原因和機制尚無報道。隨著近些年基因組學

3、的迅速發(fā)展，國外一些學者在BL中檢測到了一些熱點基因的突變，但這些研究均來自西方國家，我國BL患者的熱點基因突變情況尚無相關研究。
　　目的:
　　1.了解BL患者的臨床特征，包括LDH水平、淋巴細胞/單核細胞比值（Lymphocyte-to-monocyte ratio，LMR）的水平、Ann Arbor臨床分期、國際預后指數(shù)（International prognostic index，IPI）、治療方式及預后等情況。<

4、br>　　2.了解TOPK在BL中的表達情況，明確在BL中兩面神激酶2（Janus Kinase2，JAK2）磷酸化TOPK的作用機制。
　　3.了解中國人BL中的熱點基因：ID3、TCF3及MYC基因的突變情況。
　　方法:
　　1.收集35例BL病例的一般資料、臨床特征、實驗室檢查數(shù)據(jù)，并對患者進行隨訪，了解其預后。對收集整理的結果進行分析、歸納，總結出BL患者的臨床特點及其與預后的關系。
　　2.（1）利用

5、免疫組化技術進行TOPK、p-JAK2、p-STAT3、p-ERK1/2等抗體的免疫組化染色，并將組化結果與對應病例的預后做生存分析。（2）由PEPTIDE2.0(Houston, TX,USA)公司合成并設計包含TOPK不同酪氨酸位點的肽段，利用活化的JAK2激酶進行體外激酶試驗，觀察可被JAK2磷酸化的TOPK的位點。（3）利用Western Blot實驗檢測在3株BL細胞系Daudi、P3HR1和Raji中，TOPK及JAK2的表

6、達情況。（4）利用體外結合試驗觀察在體外及BL細胞系中JAK2和TOPK是否可以相互結合。（5）利用JAK2的激活劑IL-6及其抑制劑AG490觀察該途徑對TOPK磷酸化的影響。
　　3.用QIAGEN試劑盒提取保留完整的32例BL患者的石蠟組織DNA。利用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術擴增ID3基因的外顯子1，TCF3基因的外顯子17以及MYC基因的全部3個外顯子，產(chǎn)物進行電泳純化

7、并測序。
　　結果:
　　1.35例BL病例中，男女比例約為3：1，未成年（＜18歲）患者有13例（37.1％）。中位發(fā)病年齡為22（1-74）歲，其中有效隨訪人數(shù)為20例，5年生存率為51%。高臨床分期、高血清LDH、低LMR（<3.57）、高IPI指數(shù)、治療方式包含手術提示患者預后不良。
　　2.在35例BL患者中TOPK表達均呈彌漫強陽性，27例p-JAK2表達陽性，9例p-STAT3表達陽性，p-ERK1/2在

8、35例病例中表達均為陰性；體外激酶實驗觀察到JAK2可以磷酸化TOPK第74位的酪氨酸（Tyr74）；Western Blot實驗檢測到在Daudi細胞中TOPK及JAK2的表達均高于P3HR1及Raji細胞；體外結合試驗證實無論在體外還是Daudi細胞內JAK2和TOPK均可以相互結合；JAK2的激活劑IL-6及其抑制劑AG490可分別使TOPK Y74位點的磷酸化水平升高或降低。
　　3.我國32例BL患者的ID3、TCF3及

9、MYC突變率與西方文獻報道相似，分別為35.5%、18.8%和50.0%。我們還首次發(fā)現(xiàn)了TCF3基因及MYC基因的兩個重現(xiàn)性的突變位點:TCF3突變，C.2202G＞C p.L569V；MYC突變，C.1070A＞G p.G182D。新突變位點的發(fā)現(xiàn)，為解釋BL發(fā)生的分子機制提供了新的信息。
　　結論:
　　1.我國的BL患者中男性占大多數(shù)，人群主要為成年人，確診患者大多已到疾病晚期，且并發(fā)癥較多，5年生存率為51%。高臨

10、床分期、高血清LDH、低LMR（LMR<3.57）、高IPI指數(shù)、治療方式包含手術提示BL患者預后不良。
　　2.JAK2在BL中可以激活TOPK的Y74位點，提示JAK2可能通過在腫瘤細胞有絲分裂中發(fā)揮重要作用的絲/蘇氨酸激酶TOPK影響B(tài)L細胞的增殖，從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　3.我國BL的熱點突變基因ID3、TCF3及MYC基因的突變率與西方國家相似。我們首次發(fā)現(xiàn)了TCF3基因的突變位點：C.2202G＞C p.L