慢性骨髓增殖性疾病JAK2基因突變發(fā)生情況及其靶向治療的研究.pdf

1、【背景與目的】 JAK/STST信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在多種細(xì)胞生長(zhǎng)、活化、分化和凋亡等功能表達(dá)中發(fā)揮著十分重要的作用，它可以促發(fā)帶有酪氨酸殘基的蛋白發(fā)生磷酸化，產(chǎn)生激酶活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并將活化的信號(hào)傳導(dǎo)給下游的其他分子，引發(fā)一系列基因和蛋白水平的變化。近年來(lái)國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)PV、ET、IMF這一類的慢性骨髓增殖性疾病存在一致性的基因突變-JAK2V617F，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解這一類疾病的分子機(jī)理具有重要的意義，對(duì)于其診斷、鑒別診斷具有指導(dǎo)意義

2、，同時(shí)為其靶向治療提供了新的思路。鑒于國(guó)內(nèi)尚無(wú)類似的報(bào)道，我們檢測(cè)了137例MPD患者的JAK2V617F突變發(fā)生情況，研究其在國(guó)內(nèi)CMPD患者中的分布，建立可行可信的方法用于臨床檢測(cè)，同時(shí)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼及JAK2激酶抑制劑AG490在這類疾病的靶向治療中的潛能。 【方法】 實(shí)驗(yàn)第一部分：檢測(cè)了137例MPD患者的JAK2V617F突變發(fā)生情況。137例MPD患者為我院2000年4月至2006

3、年4月就診患者。按照WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中PV患者57例，ET患者68例，IMF患者12例，20例正常對(duì)照為我院體檢正常者。主要研究方法為：(1)基因組DNA提取； (2)等位基因特異性PCR方法擴(kuò)增JAK2基因第12號(hào)外顯子，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的方法篩選出JAK2V617F陽(yáng)性患者，對(duì)部分陽(yáng)性患者的PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序；(3)分析患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料以了解JAK2V617F陽(yáng)性患者的細(xì)胞遺傳學(xué)特征及臨床特征；

4、 實(shí)驗(yàn)第二部分：將不同濃度的伊馬替尼、AG490作用于HEL細(xì)胞系和K562細(xì)胞系，在72小時(shí)用CCK-8kit試劑盒檢測(cè)增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 【結(jié)果】 1．137例MPD患者共檢出90例JAK2V617F陽(yáng)性，總陽(yáng)性率65.69％；其中PV57例，陽(yáng)性率73.68％； ET68例，陽(yáng)性率58.82％；IMF12例，陽(yáng)性率66.67％；PV及ET患者JAK2V617F陽(yáng)性組年齡比陰性組年齡高，

5、差別有顯著意義(P<0.05)。115例進(jìn)行過(guò)染色體檢查的病人中7例存在核型異常，其中JAK2V617F陽(yáng)性5例，陽(yáng)性率為71.43％；染色體核型正常者108例，JAK2V617F陽(yáng)性74例，陽(yáng)性率68.51％：兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ET患者JAK2V617F陽(yáng)性組白細(xì)胞計(jì)數(shù)較陰性組高，差別有顯著意義(P<0.05)；陽(yáng)性組血紅蛋白與血小板計(jì)數(shù)較陰性組高，但差別無(wú)顯著意義。 2．伊馬替尼可顯著抑制HEL細(xì)胞系的生長(zhǎng)，呈劑量依賴性

6、。其作用于HEL細(xì)胞系的IC<,50>較K562細(xì)胞明顯增高；AG490在50μM時(shí)可顯著誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡，其在72h時(shí)誘導(dǎo)K562細(xì)胞系凋亡的細(xì)胞占56.2％，誘導(dǎo)HEL細(xì)胞系凋亡的細(xì)胞占60.6％。低濃度AG490對(duì)細(xì)胞系作用效果不明顯。 【結(jié)論】 1．中國(guó)PV、ET、IMF患者中JAK2V617F發(fā)生率較高，其發(fā)生與年齡存在相關(guān)性，年齡大者較易發(fā)生； 2．進(jìn)行JAK2V617F檢測(cè)有助于CMPD的診斷；

7、 3.等位基因特異性PCR方法檢測(cè)JAK2基因突變方法簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，適用于臨床開展。 4．存在染色體核型組JAK2V617F發(fā)生率較核型正常組略高。 5．JAK2V617F突變陽(yáng)性組患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)較陰性組高。 6．伊馬替尼對(duì)HEL細(xì)胞系具有明顯的抑制增殖作用和促進(jìn)凋亡作用，呈劑量依賴性，但其IC50較作用于K562細(xì)胞高。 7．50μM的AG490對(duì)HEL、K562細(xì)胞系具有明顯的促進(jìn)凋亡作用。