JAK2V617F突變?cè)诠撬柙鲋承约膊≈械囊饬x及其機(jī)制探討.pdf

1、2005年以來(lái)數(shù)個(gè)獨(dú)立的研究組報(bào)告了BCR/ABL陰性骨髓增殖性疾病(MPD)中存在JAK2基因突變，JAK2基因突變位于JAK2基因第1849位，原來(lái)的鳥(niǎo)嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代(G→T)，導(dǎo)致原位于617位的纈氨酸錯(cuò)義編碼為苯丙氨酸(JAK2V617F)。國(guó)外報(bào)告JAK2V617F突變見(jiàn)于65％～90％的真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、23％～57％的特發(fā)性血小板增多癥(ET)和35％～57％特發(fā)性骨髓纖維化(IMF)，是MPD發(fā)

2、生的重要分子機(jī)制。JAK2V617F突變引起人們廣泛關(guān)注而稱為“MPD的JAK2時(shí)代”。然而，JAK2V617F突變國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，其作為臨床診斷依據(jù)的價(jià)值仍需大量的臨床資料驗(yàn)證?JAK2V617F突變導(dǎo)致MPD的發(fā)病機(jī)制還不清楚?JAK2V617F突變相關(guān)的信號(hào)通路及其下游靶基因還有待進(jìn)一步研究?在臨床上對(duì)110例惡性血液病患者檢測(cè)了JAK2V617F基因突變，并應(yīng)用細(xì)胞模型探索JAK2V617F突變相關(guān)的信號(hào)通路及其靶基因，為相關(guān)靶向

3、藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，對(duì)闡明其作用的分子機(jī)制有重要意義。 目的: ①在臨床上探索JAK2V617F突變?cè)贐CR/ABL陰性MPD患者中的特異性、發(fā)生率及其臨床意義，并確立一種敏感特異、簡(jiǎn)便快捷的實(shí)驗(yàn)診斷體系； ②應(yīng)用細(xì)胞模型，研究JAK2V617F突變相關(guān)的信號(hào)通路； ③尋找JAK2V617F(JAK/STAT)，信號(hào)通路調(diào)控的下游靶基因，探索與細(xì)胞增殖和凋亡異常的相關(guān)性，以期進(jìn)一步闡明PV的

4、發(fā)病機(jī)制。 方法: ①臨床上對(duì)110惡性血液病患者和10例正常對(duì)照的外周血或骨髓粒細(xì)胞提取基因組DNA，采用等位基因特異性PCR(AS-PCR)、限制性內(nèi)切酶消化方法檢測(cè)JAK2V617F突變，并對(duì)BCR/ABL陰性MPD41例和正常對(duì)照2例進(jìn)行基因測(cè)序鑒定； ②選擇人紅白血病細(xì)胞株HEL細(xì)胞為模型，用上述三種方法檢測(cè)和驗(yàn)證HEL細(xì)胞模型中存在天然的JAK2V617F突變，并對(duì)HEL細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色和染

5、色體核型進(jìn)行觀察； ③應(yīng)用Western blot方法研究HEL細(xì)胞中JAK2特異性抑制劑AG490干預(yù)對(duì)JAK2/STAT5信號(hào)通路中的JAK2、STAT5、磷酸化JAK2和磷酸化STAT5蛋白表達(dá)的影響； ④CellTiter-Glo 法和FITC-AnnexinV/PI雙染后的流式細(xì)胞技術(shù)分別用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況； ⑤應(yīng)用RT-PCR技術(shù)篩選JAK2/STAT5信號(hào)通路可能的下游靶基因(GATA1、G

6、ATA2、PTTG1、bcl-x)。Western blot技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)用于進(jìn)一步檢測(cè)HEL細(xì)胞中AG490對(duì)PTTG1的蛋白表達(dá)水平的影響； ⑥雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)用于檢測(cè)AG490對(duì)PTTG1啟動(dòng)子的影響。 結(jié)果: ①AS-PCR和限制性內(nèi)切酶的方法檢測(cè)JAK2V617F陽(yáng)性的結(jié)果為：PV11/12例(91.7％)、ET8/15例（53.3％)、IMF4/7例(57.1％)。高嗜酸粒細(xì)胞增多癥（HES

7、)7例、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)25例、急性白血病44例[包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)24例、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)18例、慢性粒細(xì)胞白血病急粒變1例、急性混合細(xì)胞白血病1例]均未檢測(cè)到JAK2V617F基因突變。將所有BCR/ABL陰性MPD患者41例、正常對(duì)照2例一并進(jìn)行基因測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示AS-PCR和限制性內(nèi)切酶的方法檢測(cè)JAK2V617F陽(yáng)性的23例患者為JAK2V617F突變型，其他標(biāo)本為野生型； ②通過(guò)

8、AS-PCR、限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序，證實(shí)了HEL細(xì)胞中存在JAK2V617F突變，并且細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)觀察也提示該細(xì)胞株具有紅系細(xì)胞的形態(tài)特征； ③Western blot結(jié)果表明在總蛋白上樣量一致的情況下，隨著AG490作用時(shí)間(0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))的延長(zhǎng)，JAK2蛋白總量表達(dá)變化不大，但是磷酸化JAK2的表達(dá)逐漸下降，最大下降95.3％；同樣STAT5的總蛋白水平變化不大，磷酸化的ST

9、AT5表達(dá)水平明顯降低，最大下降72.4％。在K562細(xì)胞中，在100μM的AG490作用72小時(shí)后蛋白JAK2、磷酸化JAK2、STAT5、磷酸化STAT5的表達(dá)水平均沒(méi)有明顯變化； ④用50μM AG490干預(yù)后(0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)和120小時(shí))，HEL細(xì)胞增殖活力與對(duì)照組比較明顯降低； ⑤通過(guò)FITC-AnnexinV/PI雙染法和流式細(xì)胞技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AG490作用之后HEL細(xì)胞的凋亡率明

10、顯升高，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性； ⑥通過(guò)RT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AG490干預(yù)HEL細(xì)胞后癌基因PTTG1和凋亡相關(guān)基因Bcl-X(主要為bcl-XL)mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性；而轉(zhuǎn)錄因子GATA1和GATA2mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯變化； ⑦用100μMAG490(0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))干預(yù)HEL細(xì)胞，Westernblot技術(shù)觀察到，隨著AG490作用

11、時(shí)間的延長(zhǎng)，PTTG1的蛋白表達(dá)明顯下降；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)未加藥時(shí)PTTG1表達(dá)陽(yáng)性率為55.9％，隨著AG490作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PTTG1陽(yáng)性細(xì)胞的百分比下降，72小時(shí)后的細(xì)胞陽(yáng)性率僅為9.0％； ⑧通過(guò)雙報(bào)告基因技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AG490作用之后，PTTG1的啟動(dòng)子活性下降2.5倍。 結(jié)論: ①90％以上的PV、50％以上的ET和IMF可檢測(cè)到JAK2V617F基因突變；AS-PCR和限制性內(nèi)切酶分析是JAK2V6

12、17F基因突變敏感特異、簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法；JAK2V617F可以作為MPD診斷的分子標(biāo)志，也可能是治療的新靶點(diǎn)； ②在HEL細(xì)胞中JAK2激酶特異性抑制劑AG490可以抑制突變的JAK2V617F激酶和JAK2V617F/STAT5信號(hào)通路，使HEL細(xì)胞增殖活力明顯降低和凋亡率明顯升高；而AG490導(dǎo)致Bcl-x(主要是Bcl-XL)基因的mRNA表達(dá)明顯降低，提示JAK2V617F可能通過(guò)上調(diào)Bcl-XL抑制細(xì)胞凋亡；