JAK2V617F突變?cè)诠撬柙鲋承阅[瘤和急性髓性白血病(M2)中的實(shí)驗(yàn)和臨床研究.pdf

1、[背景與目的] 近年來(lái)慢性骨髓增殖性腫瘤(MPN)發(fā)病機(jī)制的研究取得了重要進(jìn)展，2005年幾個(gè)研究小組幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MPN患者造血細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子JAK2基因第1849位鳥(niǎo)嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取替，導(dǎo)致JAK2激酶617位纈氨酸(V)錯(cuò)義編碼為苯丙氨酸(JAK2V617F)，使JAK2分子得到持續(xù)活化，此改變可能與MPN的發(fā)病有密切的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者和半數(shù)左右原發(fā)性血小板增多癥(ET)患

2、者及原發(fā)性骨髓纖維化(MF)患者中能檢測(cè)到此突變，而在骨髓增生異常綜合癥、急性白血病患者中偶爾也能檢測(cè)到此突變。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)此突變有兩種類型——純合型突變和雜合型突變，并發(fā)現(xiàn)突變型JAK2V617F與野生型JAK2基因的比例決定MPN的表型。因此，對(duì)JAK2V617F突變的研究有利于MPN的診斷，判定疾病的預(yù)后和未來(lái)靶向治療靶點(diǎn)的選擇，成為MPN研究的熱點(diǎn)。近年國(guó)內(nèi)對(duì)JAK2V617F突變的研究主要集中于臨床檢測(cè)，未能做到對(duì)此突

3、變的進(jìn)一步基因分型和相對(duì)定量研究，針對(duì)此我們研究了中國(guó)人MPN患者和急性白血病M2型患者中JAK2V617F突變的發(fā)病率、基因分型、相對(duì)定量情況和臨床資料間的關(guān)系，總結(jié)如下。 [方法] 第一部分第一章選取2005年8月～2008年10月該院門診就診MPN患者，按照2001年WHO分類診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇患者，采集患者外周血5ml，F(xiàn)icoll-paque分離單個(gè)核細(xì)胞，運(yùn)用基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA的抽提，采用等位基因特異

4、性PCR技術(shù)(AS-PCR)擴(kuò)增JAK2基因，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，篩選出突變陽(yáng)性患者PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序證實(shí)，收集患者的臨床資料、染色體結(jié)果及隨訪結(jié)果。 第一部分第二章選取2006年1月到2008年6月間到該院就診的急性白血病M2型患者及部分我所凍存標(biāo)本作為研究對(duì)象，按照《血液學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》選擇患者，收集患者的臨床資料，采集患者的外周血，運(yùn)用AS-PCR(同第一部分第一章)擴(kuò)增JAK2基因，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行研究。

5、 第二部分和第三部分選取2006年1月到2008年6月間到該院就診的MPN患者及部分該所凍存標(biāo)本作為研究對(duì)象，按照2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)慢性骨髓增殖性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇患者，采集患者外周血10ml，F(xiàn)icoll-paque分離單個(gè)核細(xì)胞，Trizol一步法抽提總RNA，應(yīng)用鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA，采用ARMS-PCR技術(shù)擴(kuò)增JAK2基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因分型，篩選出突變陽(yáng)性患者PCR產(chǎn)物進(jìn)行

6、測(cè)序證實(shí)，并經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平的相對(duì)定量分析，染色體檢查按照常規(guī)R顯帶技術(shù)進(jìn)行，同時(shí)分析檢測(cè)結(jié)果與臨床間的關(guān)系。 [結(jié)果] 1.運(yùn)用AS-PCR方法檢測(cè)了412例MPN患者，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料顯示：共發(fā)現(xiàn)277例患者JAK2V617F突變陽(yáng)性，JAK2V617F突變?cè)谠l(fā)性血小板增多癥(ET)、特發(fā)性骨髓纖維化(IMF)及不能分類的骨髓增殖性疾病(MPD-U)中發(fā)生率分別為55.9％、

7、66.7％和52.4％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均較真性紅細(xì)胞增多癥(PV)中JAK2V617F發(fā)生率(95.6％)為低；JAK2突變型患者的平均年齡高于野生型患者；JAK2V617F陽(yáng)性組的白細(xì)胞水平及血紅蛋白水平均較JAK2V617F陰性組為高；JAK2V617陽(yáng)性組中血管事件發(fā)生率高于陰性組；具有JAK2V617F陽(yáng)性的MPD-U患者較陰性MPD-U患者更易進(jìn)展為典型MPN；301例進(jìn)行過(guò)染色體檢查的患者中，18例存在核型異常，未發(fā)現(xiàn)

8、核型異常與JAK2V617F突變之間存在相關(guān)性。 2.運(yùn)用AS-PCR方法檢測(cè)了80例AML-M2患者，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料顯示：80例AML-M2患者中共發(fā)現(xiàn)JAK2V617F陽(yáng)性7例，6例為初診患者，1例為復(fù)發(fā)患者，總陽(yáng)性率8.8％；7例JAK2V617F陽(yáng)性AML-M2患者形態(tài)學(xué)上血象、骨髓象呈現(xiàn)出白血病改變特征，并無(wú)骨髓增殖性疾病(MPD)癥象，免疫分型顯示為髓系表達(dá)；本院治療5例JAK2V617F陽(yáng)性AML-M2患

9、者，4例經(jīng)2療程誘導(dǎo)治療達(dá)完全緩解(CR)，1例未緩解(NR)；5例JAK2V617F陽(yáng)性AML-M2患者，除1例失訪外，其余4例總生存期(0S)中位值為18.5個(gè)月。 3.運(yùn)用ARMS-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)123例MPN患者，結(jié)果顯示： JAK2V617F陽(yáng)性90例，其中35例真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者中JAK2V617F陽(yáng)性35例，陽(yáng)性率100％(35/35)，85例原發(fā)性血小板增多癥(ET)患者中JAK2V617F陽(yáng)

10、性53例，陽(yáng)性率62.4％(53/85)，低于PV患者，差別有顯著性；3例慢性骨髓纖維化(IMF)患者中JAK2V617F陽(yáng)性2例，陽(yáng)性率66.7％(2/3)。90例JAK2V617F突變患者中共檢出純合突變35例，其中PV患者17例(17/35)占48.6％，ET患者17例(17/85)占20％，低于PV患者，差別有顯著性，IMF患者1例；90例毛細(xì)管電泳定量分析顯示，35例純合型突變患者JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平為(89.5±

11、6.5)％，55例雜合型突變患者JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平為(57.9±6.7)％，較純合型突變患者為低，差別有顯著性；雜合型PV患者JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平為(63.7±6.3)％，高于雜和型ET患者的(54.4±6.1)％，差別有顯著性。93例患者進(jìn)行了染色體檢查，6例有核型異常，但未發(fā)現(xiàn)特異性染色體改變。 4.運(yùn)用ARMS-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)了131例MPN患者，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料顯示：純合型JA

12、K2V617F突變ET患者和雜合型JAK2V617F突變ET患者其發(fā)病年齡均較野生型患者為高；MPN患者中年齡與JAK2V617F突變的發(fā)生間存在相關(guān)性，≥60歲患者JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平高于<60歲患者；JAK2V617F突變陽(yáng)性MPN患者(PV和ET)白細(xì)胞和血紅蛋白水平均高于陰性患者，ET患者中純合型突變者白細(xì)胞水平高于雜合型突變者；JAK2V617F突變?cè)赑V中的發(fā)生率和JAK2V617F純合型突變?cè)赑V中的發(fā)生率均較

13、JAK2V617F突變?cè)贓T中的發(fā)生率和JAK2V617F純合型突變?cè)贓T中的發(fā)生率為高；JAK2V617F轉(zhuǎn)錄本水平均值在PV、ET和IMF患者中無(wú)差別。 5.運(yùn)用ARMS-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)了105例MPN患者，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料顯示：有血栓PV、ET患者年齡、WBC數(shù)高于無(wú)血栓患者，WBC≥15×109/LET患者血栓發(fā)生率高于WBC<15×109/L患者，JAK2V617F陽(yáng)性患者血栓發(fā)生率高于陰性患者，有血

14、栓事件者JAK2V617F轉(zhuǎn)錄本水平高于無(wú)血栓事件者，JAK2V617F陽(yáng)性患者血栓事件風(fēng)險(xiǎn)度高于JAK2V617F陰性患者，突變轉(zhuǎn)錄本水平在(60-100)％組患者血栓事件風(fēng)險(xiǎn)度高于JAK2V617F陰性組患者。 [結(jié)論] 1.JAK2V617F突變與MPN患者年齡、外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及血管事件之間存在關(guān)聯(lián)性，JAK2V617F的檢測(cè)對(duì)判定MPN-U患者疾病轉(zhuǎn)歸有提示作用。 2.作為AML發(fā)病機(jī)制中的I類改變JAK

15、2V617F突變可能并非是AML發(fā)病的初始事件，而是其發(fā)病的額外事件，初診AML患者出現(xiàn)此改變也并非意味著疾病預(yù)后較差。 3.ARMS-PCR可作為JAK2V617突變分型較準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，結(jié)合毛細(xì)管電泳可用于此突變的相對(duì)定量分析。 4.ARMS-PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳定性和定量分析JAK2V617F突變可用于MPN的診斷、預(yù)后判定和微小殘留病的檢測(cè)。 5.高齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高，JAK2V617F突變及高轉(zhuǎn)錄本水平