GABA能機(jī)制參與NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、腦中風(fēng)(Stroke)是一組以腦缺血或出血型損傷,導(dǎo)致部分腦功能喪失為主要臨床表現(xiàn)的疾病。在中國(guó),腦中風(fēng)已上升為第一死亡因?yàn)?發(fā)病率排名世界第一,存活者也致殘率極高。而在西方發(fā)達(dá)國(guó)家,腦中風(fēng)是僅次于心臟疾病和癌癥,第三大的死亡因?yàn)?。臨床上對(duì)腦中風(fēng)的治療方法最常用的是溶栓療法,但是它有嚴(yán)格的時(shí)間窗的限制(<3小時(shí)),并且可能引發(fā)顱內(nèi)出血等嚴(yán)重并發(fā)癥,因此應(yīng)用受到很大的限制。為了能夠延長(zhǎng)時(shí)間窗和降低溶栓后顱內(nèi)出血的發(fā)病率,使更多的患者得到治

2、療,腦保護(hù)劑的研究顯得極為迫切。Neuregulin(NRG)是目前為止研究的比較多的一種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。
　　 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)是一種細(xì)胞之間的信號(hào)蛋白。有NRG-1,NRG-2,NRG-3和NRG-4四種亞型,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG-1)是目前為止研究的較為透徹的一種亞型。我們的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG-1)與其受體erbB4結(jié)合后,對(duì)皮層神經(jīng)元有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。然而神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG-1)發(fā)揮神經(jīng)

3、保護(hù)作用的機(jī)制,迄今為止國(guó)內(nèi)外尚無(wú)確切的相關(guān)報(bào)告。闡明這一機(jī)制,對(duì)于進(jìn)一步的了解神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在體內(nèi)的生理作用,為腦卒中的臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)是非常有意義的。
　　 本實(shí)驗(yàn)室2007年發(fā)表的一篇neuron的文章證實(shí)在前額葉皮層中GABA能神經(jīng)元的突觸前末梢存在大量的erbB4受體,NRG-1與erbB4受體結(jié)合后,可以促進(jìn)去極化誘導(dǎo)的GABA的釋放。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GABA受體激動(dòng)劑對(duì)氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元死亡有顯

4、著的保護(hù)作用。那我們的假說(shuō)是:NRG-1與GABA能神經(jīng)元表面的erbB4受體結(jié)合,可能通過(guò)促進(jìn)GABA的釋放,作用于皮層神經(jīng)元表面的GABA受體,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。具體的實(shí)驗(yàn)如下:
　　 首先,用出生一天的SD乳鼠取皮層組織,原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元,12d神經(jīng)元成熟后,用免疫組織化學(xué)的方法,標(biāo)記GAD67,計(jì)數(shù)離體的皮層神經(jīng)元中GABA神經(jīng)元的比例。結(jié)果顯示GABA神經(jīng)元占約總皮層神經(jīng)元的20％。其次,將成熟的皮層神經(jīng)元用于氧

5、.葡萄糖剝奪(OGD)/復(fù)氧(R)模型。取培養(yǎng)12天生長(zhǎng)良好的皮層神經(jīng)元,分成兩組:control組,將Neurobasal-A Medium換為有糖的EBSS平衡液,放至正常有氧孵箱；OGD/R組,將培養(yǎng)基更換為無(wú)糖EBSS平衡液,放至缺氧孵箱。4h后,control組和OGD組均更換為正常Neurobasal-AMedium培養(yǎng)基,24h后,染Hoechst33342/PI,計(jì)數(shù)PI陽(yáng)性細(xì)胞率,評(píng)估細(xì)胞死亡情況。結(jié)果顯示:contr

6、ol組和OGD/R組細(xì)胞死亡率分別為5.0478％±3.9862％和30.3178％±1.6481％(兩組相比,P<0.01),OGD/R組的神經(jīng)元死亡率明顯高于control組,模型建立成功。
　　 在OGD/R模型建立成功的基礎(chǔ)上,分別向OGD組給予NRG-1,NRG-1+ecto-erbB4(ecto-erbB4為人工提純的erbB4胞外段,可中和游離的NRG-1),NRG-1+CGP52432+BMI(CGP52432和

7、BMI分別GABA受體A,B阻斷劑),baclofen and muscimol(muscimol和baclofen分別為GABA受體A,B激動(dòng)劑),NRG-1,baclofen and muscimol。給予1nM,5nM和10nMNRG-1,細(xì)胞死亡率分別為18.7073％±1.3083％,14.5508％±1.1598％和16.7418％±1.5110％,(分別與OGD組相比,均為P<0.01),表明NRG-1可以顯著降低皮層神經(jīng)

8、元的死亡率,NRG-1對(duì)離體皮層神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用。這一結(jié)果同Byron D.Ford課題組的在體結(jié)果是一致的。erbB4+/+HER4heart(+/+)mice體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元成熟后,做OGD模型成功后,計(jì)數(shù)細(xì)胞的死亡率為29.5737％±3.1727％,而erbB4-/-HER4heart(-/-)mice的細(xì)胞死亡率為50.3186％±2.7868％,兩組相比P<0.01,erbB4-/-HER4heart(-/-)mic

9、e細(xì)胞死亡率明顯高于erbB4+/+HER4heart(+/+)mice。因此,認(rèn)為erbB4全腦敲除的mice與野生型mice相比,對(duì)OGD的敏感性增強(qiáng)。給予NRG-1+ecto-erbB4后,神經(jīng)元的死亡率為25.4851％±2.3788％(與NRG-1組相比P<0.01),可以看出ecto-erbB4可以明顯減弱NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用。以上結(jié)果表明NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)NRG-1-erbB4途徑發(fā)揮的。
　　 向

10、OGD/R模型分別加入muscimol,baclofen和baclofen+muscimol后,細(xì)胞死亡率分別為19.8850％±1.3313％,26.2343±1.1948和19.9551％±0.7647％。(與OGD組相比,均為P<0.01),結(jié)果表明GABA受體激動(dòng)劑同樣對(duì)離體的皮層神經(jīng)元有顯著的保護(hù)作用。那么GABA受體激動(dòng)劑和NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用有什么樣的聯(lián)系嗎?。為了驗(yàn)證這一現(xiàn)象,向OGD/R模型中同時(shí)加入NRG-1和G

11、ABA受體阻斷劑(CGP52432和BMI),細(xì)胞死亡率為23.6560％±1.6259％(與NRG-1組相比P<0.01),結(jié)果表明GABA受體阻斷劑部分阻斷了NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用。向OGD/R模型同時(shí)加入NRG-1和GABA受體激動(dòng)劑(muscimol+baclofen),細(xì)胞死亡率為13.3528％±1.6691％(與NRG-1組相比P>0.05),結(jié)果表明同時(shí)給予GABA受體激動(dòng)劑和NRG-1組與單獨(dú)給予NRG-1組相比,細(xì)