UPS-SUMO系統(tǒng)參與異氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、近年來，針對包括圍術(shù)期腦損傷在內(nèi)的腦缺血損傷的研究已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，如何防治腦缺血損傷也成為科學(xué)界急需解決的重大醫(yī)學(xué)問題，因此充分調(diào)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步探索理想有效的神經(jīng)保護(hù)措施顯得尤為關(guān)鍵。我們課題組早在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在缺血損傷前給予吸入性麻醉藥例如異氟烷、七氟烷等，可減小腦梗死面積誘導(dǎo)缺血耐受，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，異氟烷預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的作用機(jī)制尚未明確，蛋白質(zhì)的合成、翻譯及修飾作為細(xì)胞生存及功

2、能實(shí)現(xiàn)的重要途徑，是否介導(dǎo)腦缺血損傷及異氟烷預(yù)處理過程呢？
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）與其衍生的SUMO系統(tǒng)，分別介導(dǎo)泛素化和S UMO化這兩個(gè)重要的蛋白調(diào)控途徑，與細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)異常泛素化蛋白聚集與神經(jīng)細(xì)胞損害密切相關(guān)，然而SUMO蛋白并不促使蛋白質(zhì)降解，而是加強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性。有研究者對冬眠動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，損傷或應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)元內(nèi)結(jié)合型SUMO蛋白的增加可能對提高細(xì)胞對缺血缺氧等損傷的耐受具有重要意義。那么我們

3、進(jìn)一步思考，作為細(xì)胞調(diào)節(jié)中的兩個(gè)重要系統(tǒng)UPS和SUMO，二者在腦缺血損傷及預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中是如何發(fā)揮作用并相互調(diào)節(jié)的？
　　本課題旨在揭示UPS/SUMO系統(tǒng)參與腦缺血損傷及神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制，將有助于提高我們對腦缺血損傷的認(rèn)識，并為未來尋找基于UPS/S UMO系統(tǒng)的新的藥物或干預(yù)措施應(yīng)用于臨床神經(jīng)保護(hù)奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一異氟烷預(yù)處理對神經(jīng)細(xì)胞氧糖剝奪損傷具有保護(hù)作用
　　目的：研究異氟烷預(yù)處理對培養(yǎng)的類神經(jīng)

4、元細(xì)胞缺氧損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。
　　方法：采用SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系經(jīng)過視黃酸刺激后，誘導(dǎo)分化成為類神經(jīng)元細(xì)胞，通過檢測神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN和βⅢ-Tublin的表達(dá)變化，確定誘導(dǎo)分化成類神經(jīng)元細(xì)胞的時(shí)間。進(jìn)一步觀察異氟烷預(yù)處理對氧糖剝奪（O xyge n-glucose deprivation，OGD）損傷細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。細(xì)胞為分4組：Sham組、Iso組（單純吸烷組）、OGD組（氧糖剝奪組）、IsoPC組（異氟烷

5、預(yù)處理組）。Iso組和IsoPC組均給予2％異氟烷單次吸入2 h，OGD組和IsoPC組均進(jìn)行氧糖剝奪損傷4 h，并且在異氟烷預(yù)處理24 h后進(jìn)行。分別在復(fù)氧后24 h后進(jìn)行M TT比色法、流式細(xì)胞儀以及檢測caspase-3含量以判斷各組細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡，證實(shí)異氟烷預(yù)處理對細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：加入視黃酸刺激誘導(dǎo)分化7天后的SH-SY5Y神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)最強(qiáng)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇誘導(dǎo)分化7天的細(xì)胞進(jìn)行檢測。缺氧

6、損傷后24 h，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞活性降低，給予單次異氟烷預(yù)處理可以增加細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：視黃酸刺激可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化成類神經(jīng)元細(xì)胞；單次異氟烷預(yù)處理對氧糖剝奪損傷模型的細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)二異氟烷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血損傷具有腦保護(hù)作用
　　目的：研究異氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠缺血耐受效應(yīng)。
　　方法：SD大鼠隨機(jī)分為4組：Sham組（空白對照組）、Iso組（單純吸烷

7、組）、MCAO組（缺血損傷組）、IsoPC組（異氟烷預(yù)處理組）。Iso組和IsoPC組連續(xù)5天每天吸入2%異氟烷1 h；MCAO組和IsoPC組進(jìn)行大腦中動(dòng)脈阻閉模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO），缺血時(shí)間為120 min，缺血模型在異氟烷預(yù)處理后24 h進(jìn)行。缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)24 h、48 h、72 h、7 d分別進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分（Neurological behavioral

8、score，NBS）以及TTC染色評估腦梗死容積百分比，證實(shí)異氟烷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)果：在局灶性腦缺血損傷后24 h，大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分相比Sham組降低，腦梗死容積明顯，隨著再灌注時(shí)間延長，腦梗死容積逐漸縮小。給予異氟烷預(yù)處理可以明顯減小腦梗死容積百分比，提高神經(jīng)功能學(xué)評分，減輕大腦中動(dòng)脈阻塞模型對腦組織的損傷作用。說明異氟烷預(yù)處理對于局灶性腦缺血損傷具有腦保護(hù)作用。
　　結(jié)論：異氟烷

9、預(yù)處理對局灶性腦缺血損傷具有短期神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)三異氟烷預(yù)處理通過抑制結(jié)合型泛素蛋白聚集誘導(dǎo)腦缺血耐受
　　目的：研究泛素系統(tǒng)在腦缺血損傷和異氟烷預(yù)處理中的作用。
　　方法： SD大鼠隨機(jī)分為5組：Sha m組（空白對照組）、MC AO24 h組（缺血損傷后24 h組）、IsoPC24 h組（預(yù)處理保護(hù)24 h組）、MCAO72 h組（缺血損傷后72 h組）、IsoPC72 h組（預(yù)處理保護(hù)72 h組）（每組8

10、只）。除了Sham組以外，其它4組均進(jìn)行MCAO模型，IsoPC24 h組和IsoPC72 h組在MCAO模型前24 h給予連續(xù)5天2%異氟烷吸入每天1 h。分別在損傷后24 h和72 h進(jìn)行取材，分別進(jìn)行Ubiquitin蛋白Western blot和免熒組化染色，了解泛素蛋白系統(tǒng)在腦缺血損傷及異氟烷預(yù)處理后不同時(shí)相的變化趨勢和分布特點(diǎn)。
　　結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示局灶性腦缺血損傷后24 h即可觀察到異常泛素蛋白的聚集，并且在損

11、傷后72 h均維持在高表達(dá)，異氟烷預(yù)處理可以明顯減少泛素蛋白的表達(dá)。Western blot結(jié)果也顯示，損傷后結(jié)合型泛素蛋白表達(dá)增加，游離型泛素蛋白減少，異氟烷預(yù)處理可以完全逆轉(zhuǎn)泛素蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)論：異氟烷預(yù)處理抑制缺血后結(jié)合型泛素蛋白的聚集，發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)四異氟烷預(yù)處理通過改變SUMO系統(tǒng)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的：研究異氟烷預(yù)處理對SUMO系統(tǒng)蛋白和Ubc9蛋白表達(dá)的

12、影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。離體實(shí)驗(yàn)中，采用誘導(dǎo)分化成功的SH-SY5Y細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞共分為4組：S ha m組、Iso組、O GD組、IsoPC組，在復(fù)氧后24h進(jìn)行免疫熒光染色和Western blot檢測，觀察SUMO-1、SUMO-2/3、Ubc9蛋白的細(xì)胞分布特點(diǎn)及表達(dá)變化。在體實(shí)驗(yàn)中，將第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SD大鼠隨機(jī)分為6組：Sham組、Iso組、MCAO4 h組、IsoPC4h組、MC

13、AO24 h組、IsoPC24 h組（每組8只）。在再灌注后4 h和24 h分別進(jìn)行免疫熒光染色和Western blo t檢測，觀察 SUMO系統(tǒng)和Ubc9蛋白在腦組織中的表達(dá)及蛋白含量變化。明確SUMO系統(tǒng)以及SUMO連接酶Ubc9參與缺血損傷和神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　結(jié)果：離體實(shí)驗(yàn)中，在OGD損傷后24 h，結(jié)合型SUMO-1表達(dá)減少，游離型SUMO-1表達(dá)增加，異氟烷預(yù)處理可以上調(diào)結(jié)合型SUMO-1蛋白表達(dá)，抑制游離型S

14、UMO-1水平；然而結(jié)合型 S UMO-2/3在損傷后表達(dá)升高，異氟烷預(yù)處理可減少SUMO-2/3表達(dá)；復(fù)氧4 h和24 h后Ubc9的表達(dá)均明顯減少，且在4 h達(dá)到最低，異氟烷預(yù)處理可以增加Ubc9的表達(dá)，但是在損傷后24 h影響不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在體實(shí)驗(yàn)中SUMO-1的表達(dá)減少，在24 h基本恢復(fù)到正常水平，異氟烷預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)缺血對SUMO-1表達(dá)的抑制作用；缺血損傷可以增加結(jié)合型SUMO-2/3蛋白的聚集，但是異氟烷預(yù)處理對

15、結(jié)合型SUMO-2/3的表達(dá)沒有影響；Ubc9在缺血后表達(dá)下調(diào)，異氟烷預(yù)處理可以增加Ubc9的表達(dá)。說明SUMO系統(tǒng)參與缺血損傷及異氟烷預(yù)處理作用。
　　結(jié)論：異氟烷預(yù)處理通過調(diào)節(jié)S UMO蛋白和Ubc9蛋白的表達(dá)調(diào)控神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)五調(diào)控Ubc9對異氟烷預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用影響研究
　　目的：研究調(diào)控SUMO化的E2酶Ubc9蛋白異氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)

16、兩部分。離體實(shí)驗(yàn)中，采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)Ubc9的SH-SY5Y細(xì)胞系，用siRNA下調(diào)細(xì)胞Ubc9的表達(dá)，之后再進(jìn)行異氟烷預(yù)處理和OGD模型。實(shí)驗(yàn)分為8組：Sham組、Iso組、OGD組、IsoPC組、Lenti+OGD組（過表達(dá)慢病毒+氧糖剝奪損傷組）、Lenti+IsoPC組（過表達(dá)慢病毒組+異氟烷預(yù)處理組）、siRNA+OGD組（小干擾 RNA+氧糖剝奪損傷組）、siRNA+IsoPC組（小干擾RNA+異氟烷預(yù)處理

17、組）。復(fù)氧后24 h通過MTT比色法和檢測caspase-3的含量觀察類神經(jīng)元在氧糖剝奪損傷后和異氟烷預(yù)處理后細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡程度。在體實(shí)驗(yàn)中，給予大鼠側(cè)腦室微注射siRNA，下調(diào)大鼠腦組織中Ubc9的表達(dá)，隨后進(jìn)行異氟烷預(yù)處理和大腦中動(dòng)脈阻閉模型。實(shí)驗(yàn)分為6組：Sha m組、Iso組、MCAO組、IsoPC組、siRNA+MCAO組、siRNA+IsoPC組（每組8只）。在再灌注損傷后24 h評估神經(jīng)功能學(xué)評分和觀察腦梗死容積百分比

18、，證實(shí)S UMO連接酶Ubc9在異氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)缺血耐受中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：慢病毒過表達(dá)載體可以增加細(xì)胞Ubc9和SUMO-1的表達(dá)，siRNA可以抑制Ubc9和SUMO-1的蛋白水平，但是二者對SUMO-2/3的表達(dá)均沒有影響。上調(diào)Ubc9的表達(dá)可以模擬神經(jīng)保護(hù)作用；下調(diào)Ubc9蛋白可以增加細(xì)胞對氧糖剝奪損傷的敏感性，并且逆轉(zhuǎn)異氟烷預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用。給予大鼠側(cè)腦室微注射siRNA-Ubc9可以下調(diào)大鼠腦組織Ubc9的表