Notch信號通路在七氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、常用吸入麻醉劑七氟烷可誘導(dǎo)腦缺血耐受，但機(jī)制不清，有待深入研究。Notch信號是一種進(jìn)化保守的信號通路，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間信號交換，影響神經(jīng)發(fā)育過程中的細(xì)胞分化、增殖與凋亡等多種程序。近年來的研究亦證實(shí)Notch信號通過影響細(xì)胞凋亡參與腦缺血再灌注損傷。這提示Notch信號通路有可能也是調(diào)控七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)作用的重要信號通路。如能明確這一問題，將有望為腦缺血防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　因此，本課題以局灶性腦缺血模型為對象，應(yīng)用Not

2、ch轉(zhuǎn)錄因子RBP-J基因敲除小鼠，研究經(jīng)典Notch通路在常用吸入麻醉劑七氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)腦保護(hù)效應(yīng)中的作用及機(jī)制，并對Notch與另一重要信號通路JAK-STAT在腦缺血損傷中的相互作用關(guān)系做以闡釋，以期為七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)機(jī)制提供新的思路，為腦保護(hù)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和干預(yù)靶點(diǎn)。
　　第一部分：Notch信號通路在局灶性腦缺血損傷中的作用及機(jī)制
　　目的：
　　1.研究腦缺血再灌注對Notch信號通路表達(dá)的影響<

3、br>　　2.研究Notch信號通路在腦缺血再灌注中的作用
　　方法：
　　1．小鼠局灶性腦缺血再灌注后Notch信號表達(dá)變化
　　雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（Sham,n=5）和缺血再灌注組(MCAO)，MCAO組進(jìn)行1h缺血，于再灌注后2h、24h、72h取半暗帶組織（每組n=5），Western blot方法檢測NICD蛋白含量，Real-time PCR方法檢測Hes1和Hes5靶基因mRNA

4、水平。
　　2．Notch信號抑制劑對小鼠局灶性腦缺血損傷的影響
　　雄性C57BL/6小鼠36只隨機(jī)分為3組（每組n=12）：假手術(shù)組（Sham）、缺血再灌注組(MCAO)和DAPT組。MCAO組僅給予1h大腦中動脈阻閉，DAPT組于MCAO模型制作前2h給予Notch通路抑制劑DAPT，100mg/kg，i.p.。3組均于再灌注后2h、24h、72h分別按照Garcia和Longa兩種方法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，再灌注后72

5、h計算梗死容積。
　　3.RBP-J基因敲除對腦缺血再灌注損傷的影響
　　雄性野生型C57BL/6小鼠（Wildtype，WT）、雄性RBP-J基因敲除小鼠（RBP-J-/-）和與其同窩出生、性別相同、發(fā)育一致的雜合子小鼠（RBP-J+/-）共3組（每組n=12）。所有動物均給予MCAO1h，于再灌注后2h、24h、72h分別按照Garcia和Longa兩種方法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分；再灌注后24h每組隨機(jī)取5只小鼠進(jìn)行灌注，取

6、腦組織冰凍切片進(jìn)行Caspase-3染色和TUNEL染色,其余小鼠于再灌注后72h進(jìn)行TTC染色計算梗死容積。
　　結(jié)果：
　　1．腦缺血再灌注增加半暗帶NICD蛋白含量
　　Western blot顯示缺血再灌注后2h，缺血半暗帶NICD含量是Sham組的1.74±0.31倍；缺血再灌注后24h，NICD含量進(jìn)一步增加，是Sham的2.62±0.32倍，并明顯高于MCAO后2h組(P<0.05)；缺血再灌注后72hN

7、ICD含量增加到Sham組的3.28±0.19倍，仍高于24h組(P<0.05)。
　　2.腦缺血再灌注增加半暗帶Hes1和Hes5基因轉(zhuǎn)錄
　　Real-timePCR結(jié)果顯示，Hes1mRNA于再灌注后24h較Sham組顯著增加（P<0.05vs.Sham），MCAO后72hHes1mRNA水平亦明顯高于24h組（P<0.05）。Hes5mRNA于再灌注后24h顯著上升（P<0.05vs.Sham），再灌注72h仍顯著高

8、于Sham組（P<0.05），但與24h比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3．DAPT減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷
　　缺血前給予DAPT，小鼠腦缺后24、48、72h神經(jīng)行為學(xué)Garica評分均明顯高于MCAO組（P<0.05），而Longa方法評估的神經(jīng)功能損傷評分在再灌注后72h顯著低于MCAO組（P<0.05）。DAPT組動物的腦梗死容積顯著小于MCAO組（P<0.05）。
　　4.構(gòu)建RBP-J基因敲除小鼠
　　

9、含有CamKII-Cre和RBP-J雙轉(zhuǎn)基因小鼠相互交配后子代產(chǎn)出中，RBP-J基因敲除純合子與雜合子小鼠的比例符合孟德爾遺傳定律。純合子及雜合子小鼠均發(fā)育正常，無體重、活力等異常。小鼠剪尾提取基因組，經(jīng)PCR方法鑒定基因型。免疫組化結(jié)果顯示，RBP-J敲除純合子與野生型小鼠相比，海馬和皮層NICD陽性神經(jīng)元明顯減少；Hes1和Hes5蛋白在RBP-J敲除純合子小鼠腦組織切片中表達(dá)微弱。
　　5.RBP-J基因敲除減輕腦缺血再灌注

10、損傷
　　缺血再灌注后24h、48h、72h，RBP-J-/-組神經(jīng)行為學(xué)Garica評分明顯高于MCAO組和RBP-J+/-組（P<0.05），MCAO組和RBP-J+/-組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。RBP-J-/-組神經(jīng)功能損傷Longa評分在再灌注后72h較其他兩組顯著下降（P<0.05），其他兩組之間亦無統(tǒng)計學(xué)差異。RBP-J-/-組腦梗死容積百分比較WT和RBP-J+/-顯著下降（P<0.05），WT和RBP-J+/-之間無顯著

11、性差異。
　　TUNEL及Caspase-3染色顯示，WT組TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞明顯多于RBP-J-/-組，RBP-J+/-小鼠MCAO后凋亡細(xì)胞亦多于RBP-J-/-組，但WT和RBP-J+/-兩組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差別。
　　第二部分：腦缺血再灌損傷中Notch調(diào)控JAK-STAT信號活化機(jī)制
　　目的：
　　1.研究腦缺血再灌注對于Notch信號及STAT3分子的活化是否一致
　　2.探

12、討腦缺血損傷后STAT3活化是否受到Notch信號調(diào)控
　　方法：
　　1.腦缺血再灌注后Notch與JAK-STAT通路活化的相關(guān)性
　　野生型雄性C57BL/6小鼠20只，分空白對照組（Naive）和缺血再灌注組(MCAO)。Na?ve組（n=5）不給予任何處理，取缺血半暗帶相似區(qū)腦組織。在再灌注后2h、24h、72h（n=5）分別取MCAO組缺血半暗帶腦組織。冰上提取腦組織蛋白質(zhì)，并進(jìn)行定量，采用Westernb

13、lot分別檢測NICD、Hes1、Hes5、STAT3、pSTAT3蛋白水平。證實(shí)腦缺血再灌注后Notch-Hes經(jīng)典活化級聯(lián)通路與STAT3是否同時被激活。
　　2．腦缺血后Notch信號激活對STAT3活化的影響
　　雄性RBP-J基因敲除小鼠（RBP-J-/-）16只，分為空白對照組（Naive）和缺血再灌注組(MCAO)。Na?ve組（n=4）不給予任何處理，在缺血半暗帶野生型雄性C57BL/6小鼠30只，分為6個組

14、：Hes1-SiRNA、Hes5-SiRNA、Vehicle、Hes1-SiRNA+MCAO、Hes5-SiRNA+MCAO、Vehicle+MCAO。再灌注后24h取腦組織，采用Westernblot方法檢測，Hes1、Hes5、STAT3和pSTAT3的蛋白含量變化。證實(shí)STAT3磷酸化是否由Hes蛋白調(diào)控激活。
　　結(jié)果：
　　1.腦缺血再灌注激活Notch信號和STAT3分子
　　野生型小鼠MCAO后2h、24

15、h、72hNICD蛋白含量逐漸增高。Notch靶基因Hes1、Hes5蛋白含量于再灌注后24h和72h均明顯高于Na?ve組及再灌注2h組，但Hes1或Hes5蛋白在再灌注后24h與72h兩組間均無顯著性差異。缺血再灌注后腦組織內(nèi)STAT3蛋白含量與Naive組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，而pSTAT3/STAT3水平在再灌注后2h顯著升高，在2h、24h、72h三組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2．腦缺血再灌注后STAT3分子激活受Notch信號

16、調(diào)控
　　RBP-J-/-小鼠再灌注后2h，NICD蛋白含量較Na?ve組顯著增加，2h、24h、72h三組之間無顯著性差異，Hes1、Hes5、STAT3、pSTAT3/STAT3含量則無明顯改變。結(jié)果證實(shí)敲除Notch信號轉(zhuǎn)錄因子RBP-J，腦缺血再灌注后STAT3分子磷酸化受到抑制。
　　3．Hes1-SiRNA和Hes5-SiRNA分別抑制Hes1和Hes5蛋白表達(dá)
　　SiRNA腦室注射后24h，野生型小鼠腦

17、組織Hes1蛋白表達(dá)較基礎(chǔ)值降低，48h至72h仍維持在較低水平。Hes5-SiRNA注射后24h能夠顯著抑制小鼠腦組織Hes5蛋白的表達(dá)，注射后48h至72h仍具有抑制效應(yīng)。
　　4.STAT3分子磷酸化受Hes1蛋白調(diào)控的相似區(qū)取腦組織。MCAO組小鼠于再灌注后2h、24h、72h取缺血半暗帶腦組織（n=4），提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白定量。Westernblot檢測Hes1、Hes5、STAT3、pSTAT3蛋白水平。證實(shí)STAT

18、3活化是否受Notch信號通路調(diào)控。
　　3．Hes蛋白調(diào)控STAT3磷酸化
　　腦缺血再灌注后24h，Hes1-SiRNA組Hes1蛋白含量明顯低于Vehicle組，SiRNA+MCAO組Hes1蛋白的含量亦明顯低于Vehicle+MCAO組，證實(shí)Hes1-SiRNA能抑制生理水平及MCAO后Hes1蛋白表達(dá)；STAT3蛋白含量在四組中無顯著性變化；pSTAT3在Hes1-SiRNA和Vehicle組無表達(dá)，在SiRNA+

19、MCAO組僅有輕微條帶，Vehicle+MCAO組pSTAT3表達(dá)水平較其他三組顯著增加。
　　腦缺血再灌注后24h，與Vehicle組相比，Hes5-SiRNA組Hes5蛋白含量明顯降低，Hes5-SiRNA+MCAO組Hes5蛋白的含量亦低于Vehicle+MCAO；STAT3蛋白含量在四組中保持穩(wěn)定；SiRNA+MCAO組和Vehicle+MCAO組的pSTAT3水平均明顯高于SiRNA和Vehicle組，兩組間無差異。

20、r>　　第三部分：Notch信號通路參與七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的：
　　1.研究七氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)小鼠腦缺血耐受效應(yīng)
　　2.研究七氟烷預(yù)處理對于腦組織中Notch信號表達(dá)的影響
　　3.研究Notch信號通路在七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)中的作用
　　方法：
　　1.七氟烷預(yù)處理的腦耐受效應(yīng)研究
　　將30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組（n=10）：假手術(shù)組（Sham）、缺血再灌注組（MC

21、AO）、七氟烷預(yù)處理組（Sevo+MCAO）。Sevo+MCAO組小鼠接受2.5％七氟烷與100％氧氣混合氣體的預(yù)處理，1h/d，連續(xù)5d，末次預(yù)處理后24小時行MCAO。所有動物與再灌注后24h、48h、72h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分（Garcia），末次評分后斷頭取腦，進(jìn)行TTC染色計算腦梗死容積百分比。
　　2.七氟烷預(yù)處理對Notch信號通路表達(dá)的影響
　　10只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組（n=5）：假處理組（Sh

22、am）和預(yù)處理組（Sevo），預(yù)處理接受2.5％七氟烷，1h/d，連續(xù)5天的預(yù)處理，Sham組接受同時程的氧氣處理。所有動物于末次預(yù)處理后0h、2h、24h取腦組織；將所取腦組織用Western blot方法檢測NICD蛋白含量，Real-timePCR方法檢測Hes1和Hes5靶基因mRNA水平。
　　3.七氟烷預(yù)處理對腦缺血再灌注后Notch信號通路表達(dá)的影響
　　雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組(n=5)：假手術(shù)組(

23、Sham)、MCAO組、預(yù)處理組(Sevo+MCAO),所有動物于再灌注后2h、24h、72h取腦組織,Western blot檢測NICD蛋白含量,Real-time PCR檢測Hes1和Hes5靶基因mRNA水平。
　　4. Notch信號通路抑制劑對小鼠局灶性腦缺血損傷的影響
　　雄性C57BL/6小鼠50只隨機(jī)分為5組(每組n=10)：假手術(shù)組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、DAPT組、七氟烷預(yù)處理組(S

24、evo)、七氟烷預(yù)處理聯(lián)合DAPT組(Sevo+DAPT)。Sevo+DAPT在每次預(yù)處理前經(jīng)腹腔注射給予DAPT 100mg/kg, DAPT組和Vehicle在同一時間分別給予相同容積的DAPT及其溶劑DMSO。所有動物于預(yù)處理后24h接受MCAO,再灌注后24h、48h、72h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,末次評分后斷頭取腦測定腦梗死容積百分比。
　　5.RBP-J基因敲除對七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)作用的影響
　　取雄性野生型C57B

25、L/6小鼠(WT)24只、雄性RBP-J基因敲除小鼠(RBP-J-/-)12只,與其同窩出生、性別相同、發(fā)育一致的雜合子小鼠(RBP-J+/-)12只,分成4組(n=12)：野生型(WT)、七氟烷預(yù)處理(Sevo)、RBP-J基因敲除純合子(Sevo+RBP-J-+-)、RBP-J基因敲除純合子(Sevo+RBP-J)。所有動物均接受MCAO 1h,再灌注后24h隨機(jī)每組取4只小鼠進(jìn)行多聚甲醛灌注,取腦組織冰凍切片進(jìn)行Caspase-3

26、染色和TUNEL染色。其余小鼠于再灌注后24h、48h、72h按照進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分；末次評分后進(jìn)行TTC染色,測定腦梗死容積。
　　結(jié)果:1.七氟烷預(yù)處理減輕腦缺血再灌注損傷 與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比,七氟烷預(yù)處理于再灌注后24h、48h、72h神經(jīng)行為學(xué)評分均有明顯提高,再灌注后72h Sevo+MCAO組的神經(jīng)學(xué)評分高于48h組。Sevo+MCAO組小鼠再灌注72h腦梗死容積明顯小于MCAO組。 2.七氟烷預(yù)處理激活Notch

27、信號通路 Western blot結(jié)果顯示重復(fù)七氟烷預(yù)處理后2h內(nèi),Notch受體胞內(nèi)活性片段NICD蛋白表達(dá)迅速增加,預(yù)處理后24h,NICD含量仍然高于基礎(chǔ)值,但小于2h峰值。Real-time PCR結(jié)果顯示,Notch靶基因Hesl的mRNA水平在預(yù)處理后也明顯上升,2h達(dá)高峰,24h下降但仍高于基礎(chǔ)值。另一靶基因Hes5的mRNA于預(yù)處理后2h亦明顯增加,但24h時mRNA水平于基礎(chǔ)值無統(tǒng)計學(xué)差異。 3.七氟烷預(yù)處理降低缺血再

28、灌注后Notch信號活化峰值 七氟烷預(yù)處理使缺血再灌注后NICD含量增加,蛋白表達(dá)高峰位于再灌注后24h。Sevo+MCAO組NICD含量于再灌注后2h和24h明顯高于Sham組(P0.05),但與單純?nèi)毖俟嘧CAO組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。再灌注后72h, Sevo+MCAO組NICD含量雖高于Sham組(P0.05),但顯著小于MCAO組(P0.05),再灌注后NICD蛋白表達(dá)高峰下降。 腦缺血再灌注后72h內(nèi)Notch信號靶基因He

29、s1 mRNA水平持續(xù)增高,七氟烷預(yù)處理使Hes1mRNA于缺血再灌注后24h也明顯高于Sham組(P0.05)。但與MCAO組無統(tǒng)計學(xué)差異。再灌注后72h, Sevo+MCAO組HeslmRNA則明顯低于MCAO組72h (P0.05),腦缺血再灌注后Hesl轉(zhuǎn)錄高峰被降低。然而,Sevo+MCAO組Hes5 mRNA水平在再灌注后2h和24h均高于Sham組(P0.05),72h與基礎(chǔ)值無差異,三個時間點(diǎn)Hes5 mRNA水平與MC

30、AO組均無顯著性差異。 4.DAPT逆轉(zhuǎn)七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)作用七氟烷預(yù)處理減小腦梗死容積百分比,誘導(dǎo)腦缺血耐受。單獨(dú)給予γ-分泌酶抑制劑DAPT或其溶劑,兩組小鼠腦梗死體積無差異。而Sevo+DAPT與Sevo相比,腦梗死容積明顯增加,與Vehicle組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。腦缺血后48h和72h,Sevo較Vehicle組神經(jīng)行為學(xué)評分顯著提高,而Sevo+DAPT組神經(jīng)行為學(xué)評分則較Sevo降低,與、Vehicle和DAPT無差異。 5

31、.RBP-J基因敲除消除七氟烷預(yù)處理腦保護(hù)作用Sevo+RBP-J-/-組小鼠腦梗死容積百分比較WT顯著降低(P0.05),但與Sevo組比無統(tǒng)計學(xué)差異。Sevo+RBP-J-/-與Sevo相比,腦梗死容積則顯著增加(P0.05)。再灌注后24h、48h、72h, Sevo和Sevo+RBP-J+/-組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯高于WT組(P0.05),但兩組之間無差異。Sevo+RBP-J-/-組神經(jīng)行為學(xué)評分則顯著低于Sevo組(P0.05

32、),與WT組間無差異。腦缺血再灌注后24h行TUNEL及Caspase-3染色,在顯微鏡下取半暗帶皮層進(jìn)行拍照并比較凋亡陽性神經(jīng)元數(shù)目。Sevo和Sevo+RBP-J+/-組TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞明顯少于WT組,兩者之間無差異,而Sevo+RBP-J-/-組后凋亡細(xì)胞TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞則多于Sevo組,與WT組之間沒有顯著性差別。
　　結(jié)論:1. Notch信號通路于腦缺血再灌注后激活,參與腦缺