Notch信號通路在重復HBO預處理腦保護效應中的作用研究.pdf

1、缺血性腦卒中是臨床上常見的腦血管意外,已被世界衛(wèi)生組織(WHO)認定為危害人類健康的“頭號殺手”。目前仍無有效的防治措施!近年來大量的研究發(fā)現(xiàn),各種不同的非缺血預處理方式均誘導出相同的缺血耐受效應,由此我們推測,這些不同的預處理方式極有可能作用于一些共同的信號通路從而誘導保護作用。目前已證實對胚胎發(fā)育具有重要作用的Notch信號通路在腦缺血損傷和修復中也扮演了一定的角色。高壓氧(hyperbaric oxygen, HBO)由于其安全可

2、靠及可操作性強的優(yōu)勢,作為非缺血預處理的一個重要研究方向,其神經(jīng)保護作用已得到臨床證實。故本研究主要采用高壓氧預處理的方式研究其對Notch信號通路的影響以及Notch信號通路在其腦保護中所起的作用。
　　第一部分重復HBO預處理對Notch信號通路的影響研究
　　方法：1、重復驗證高壓氧預處理的腦保護效應30只雄性SD大鼠隨機分為三組:假手術組(sham),缺血再灌注組(I/R),高壓氧預處理組(HBO+I/R)。高壓氧預

3、處理條件參照Xiong L等方法。末次預處理后24h,行MCAO缺血2h,于再灌注24,48,72h進行神經(jīng)行為學評分,于72h斷頭取腦測定腦梗死面積。
　　2、重復HBO預處理對Notch信號通路的影響研究
　　2.1、腦缺血再灌注后Notch信號通路的表達變化48只雄性SD大鼠隨機分為兩組:假手術組(sham,n=12),缺血再灌注組(I/R,n=36)。I/R組行MCAO缺血2h,再灌注后2,24,72h取缺血側皮層及

4、紋狀體。利用免疫熒光,Western blotting技術檢測各時相點Notch信號通路活性分子NICD的表達情況,同時利用RT-PCR技術測定其下游基因HES-1的表達情況。
　　2.2、高壓氧預處理后Notch信號通路的表達變化雄性SD大鼠96只(280~320g)隨機分為四組:假手術組(sham,n=12),缺血再灌注組(I/R,n=36),單純高壓氧組(HBO only,n=12),高壓氧+缺血再灌注組(HBO+I/R,n

5、=36)。末次高壓氧預處理后24h,HBO only組取材;I/R組、HBO+I/R組一起建立MCAO模型缺血2h,再灌注后2,24,72h取缺血側皮層及紋狀體。利用免疫熒光,Western blotting技術檢測各時相點Notch信號通路活性分子NICD的表達情況,同時利用RT-PCR技術測定其下游基因HES-1的表達情況。
　　結果：1、高壓氧預處理具有腦保護效應再灌注后24,48,72h神經(jīng)功能學評分,HBO+I/R組明顯

6、優(yōu)于I/R組(P＜0.05);再灌注后72h,HBO+I/R組梗死面積明顯降低(P＜0.01vs. I/R組)。
　　2、重復HBO預處理對Notch信號通路的影響研究
　　2.1、Western Blotting缺血側紋狀體:結果顯示,sham組NICD表達較弱;I/R組再灌注后24h時NICD開始增高(*P＜0.05 vs. sham),再灌注72h時表達最高($P＜0.05 vs. I/R24h)。高壓氧預處理后缺血前

7、(即HBO only組)NICD表達即有明顯增加(＃P＜0.05 vs. sham)至缺血再灌注2h,24h時表達逐漸增高,而再灌注72h時表達降低;再灌注24h時表達最高(+P＜0.05 vs. HBO+I/R2h)。HBO+I/R組再灌注后2h NICD的表達高于I/R組同時間點,而再灌注后24h,72h則反之(＃P＜0.05 HBO+I/R vs. I/R)。缺血側皮層:結果顯示,sham組NICD表達較弱;I/R組再灌注后24h

8、時NICD開始增高(*P＜0.05 vs. sham),再灌注72h時表達最高($P＜0.05 vs. I/R24h)。HBO+I/R組再灌注2h時NICD表達明顯增高(&P＜0.05 vs. sham)持續(xù)增高至再灌注24h(+P＜0.05 vs. HBO+I/R2h),再灌注72h時表達降低。HBO+I/R組再灌注2h時NICD表達高于I/R組相同時間點(＃P＜0.05),而再灌注后72h則反之。從總的趨勢可以看出,相對于I/R組,

9、HBO+I/R組NICD的表達高峰前移。
　　2.2、Real Time-PCR缺血側紋狀體:假手術組HES-1 mRNA水平較弱,I/R組再灌注后出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象,分別位于再灌注2h,72h(P＜0.05 vs. sham)時;再灌注72h時轉錄水平最高($P＜0.05 vs. I/R2h)。HES-1 mRNA的水平在高壓氧預處理后缺血前(即HBO only組)即有明顯增高(＃P＜0.05 vs. sham),再灌注后2h時達峰(

10、+P＜0.05 vs. HBO only& HBO+I/R24,72h),隨后逐漸降低;再灌注2h,24h時HBO+I/R組HES-1 mRNA水平高于I/R組(＃P＜0.05),而再灌注后72h時低于I/R組(＃P＜0.05)。缺血側皮層HES-1 mRNA水平變化趨勢同缺血側紋狀體。
　　2.3、免疫熒光免疫熒光雙標記染色顯示假手術組切片NICD樣免疫反應陽性細胞較少,I/R組再灌注后24h NICD樣陽性細胞明顯增多,至72

11、h呈持續(xù)增高趨勢。而高壓氧預處理組,缺血前NICD陽性細胞即有明顯的增加,缺血再灌注后呈逐漸增加趨勢,再灌注后24h(達高峰)NICD陽性細胞最多,而再灌注后72h時陽性細胞明顯減少。
　　結論：1、大鼠局灶性腦缺血后,Notch信號通路被激活;
　　2、HBO預處理激活了Notch信號通路,并且使缺血再灌注后Notch信號相關分子NICD、HES-1表達高峰前移,提示其參與HBO預處理的腦保護效應。
　　第二部分阻斷

12、Notch信號通路對重復HBO預處理腦保護作用影響
　　研究方法：1、驗證抑制劑的效果雄性SD大鼠12只(280~320g)隨機分為三組(n=4):正常對照(sham)組;單純高壓氧(HBO only)組:行連續(xù)5d高壓氧;DAPT+HBO組:高壓氧預處理前3h給予50μm/L5μL DAPT。各組動物于末次預處理后24h處死取材利用Western blotting方法檢測紋狀體NICD的水平。
　　2、阻斷Notch信號通

13、路對重復高壓氧預處理腦保護作用影響雄性SD大鼠60只(280~320g)隨機分為六組(n=10):假手術(sham)組,缺血再灌注(I/R)組,DAPT+缺血再灌注(DAPT+I/R)組,高壓氧+缺血再灌注(HBO+I/R)組,溶劑對照預處理(Vehicle+HBO+I/R)組,DAPT+預處理(DAPT+HBO+I/R)組。DAPT于每次高壓氧前3h經(jīng)側腦室給予,末次高壓氧預處理后24h,建立MCAO模型缺血2h,再灌注24,48,7

14、2h各時相點分別對各組進行神經(jīng)行為學評分,于再灌注72h斷頭取腦測定腦梗死面積。
　　結果：1、驗證抑制劑的效果與sham和HBO only組相比,DAPT+HBO組NICD的水平明顯降低(＃P＜0.05),提示給藥成功。
　　2、阻斷Notch信號通路對重復高壓氧預處理腦保護作用影響再灌注后24,48,72h神經(jīng)功能學評分,HBO+I/R組明顯優(yōu)于DAPT+HBO+I/R組(＃P＜0.05);Vehicle+HBO+I/R

15、組與HBO+I/R組沒有統(tǒng)計學差異。再灌注后72h,DAPT+HBO+I/R組梗死面積明顯增大(＃P＜0.05 vs. HBO+I/R組);Vehicle+HBO+I/R組與HBO+I/R組沒有統(tǒng)計學差異。
　　結論：應用Notch信號通路抑制劑DAPT可以部分逆轉HBO預處理的腦保護效應,進一步證實Notch信號通路參與了HBO預處理的腦保護效應。
　　小結：1、大鼠局灶性腦缺血后,Notch信號通路被激活;
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