異氟烷預(yù)處理在鼠腦缺血再灌注損傷中線粒體介導(dǎo)保護(hù)機(jī)制的探討.pdf

1、預(yù)處理(preconditioning，PC)作為機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，在臨床上越來(lái)越受到人們關(guān)注，由于缺血其本身是傷害性應(yīng)激過(guò)程，對(duì)機(jī)體是一種創(chuàng)傷，使缺血預(yù)處理(ischemicpreconditioning，IPC)在臨床上的應(yīng)用受到限制；因此，藥物預(yù)處理則具有更重要的臨床意義。 自1997年兩個(gè)麻醉研究組Cason和Kersten首次分別報(bào)導(dǎo)了異氟烷模擬預(yù)處理作用以來(lái)，圍繞麻醉藥預(yù)處理(anestheticprecondit

2、ioning，APC)對(duì)心肌缺血再灌注損傷進(jìn)行很多研究，雖其作用機(jī)制仍尚有諸多爭(zhēng)論，但近年來(lái)的研究認(rèn)為APC與IPC作用機(jī)制相似，目前認(rèn)為線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(mitochondrialadenosinetriphosphate-sensitivepotassiumchannel，mitoKATP)是APC作用的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥預(yù)處理(volatileanestheticpreconditioning，VAPC)的心肌保

3、護(hù)作用與mitoKATP開放有關(guān)。 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)含有大量的mitoKATP，甚至是心肌的3～7倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥不僅促進(jìn)mitoKATP開放，還具有抑制血小板聚集及白細(xì)胞粘附作用，但mitoKATP開放前的信號(hào)傳導(dǎo)及開放后如何對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用尚不清楚。所以，VAPC對(duì)腦缺血損傷的作用機(jī)制尚待研究。 線粒體是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜而敏感的重要細(xì)胞器，研究表明缺血引起細(xì)胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載，線粒體通

4、透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)參與了神經(jīng)損傷，并且是缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)所致腦細(xì)胞損傷的關(guān)鍵部位。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的多個(gè)關(guān)鍵性步驟都涉及線粒體。有報(bào)道證實(shí)凋亡能夠加重缺血性腦損傷的程度，且抗凋亡蛋白如Bcl-2阻止參與凋亡蛋白的過(guò)度表達(dá)，從而減輕腦缺血性損傷。反之，降低Bcl-2的表達(dá)則加重腦損傷。當(dāng)MPTP與促凋亡蛋白B

5、ax結(jié)合后，MPTP開放，釋放細(xì)胞色素C(cytochromec，cytC)及凋亡誘導(dǎo)因子(apotosisinducingfactor，AIF)等物質(zhì)，與Bax作用相反，抑制凋亡蛋白Bcl-2可阻止MPTP與Bax結(jié)合及其選擇性通道的形成，阻斷凋亡通路。 吸入麻醉藥異氟烷(isoflurane，ISO)預(yù)處理是否通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑產(chǎn)生腦保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)沙士鼠腦I/R模型探討異氟烷預(yù)處理作用的線粒體介導(dǎo)的細(xì)

6、胞凋亡機(jī)制，以及是否通過(guò)一氧化氮(nitricoxide，NO)信號(hào)傳導(dǎo)，更好地揭示吸入麻醉藥預(yù)處理的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。本研究分三部分：第一、異氟烷預(yù)處理對(duì)鼠腦缺血再灌注線粒體超微結(jié)構(gòu)和通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道的影響；第二、異氟烷預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷Bcl-2和Bax的mRNA在鼠腦組織中表達(dá)的影響；第三、異氟烷預(yù)處理對(duì)鼠腦缺血再灌注作用的一氧化氮信號(hào)傳導(dǎo)的探討。 實(shí)驗(yàn)材料和方法：一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性蒙古沙士鼠99只，體

7、重55～85g2.主要試劑及藥品：ISO(雅培公司)，5-HD(5-羥基葵酸鹽)、AG(氨基胍)、Fura-2/AM、EGTA(sigma公司)，牛血清白蛋白(北京紅星生物化學(xué)制品廠)，RNA裂解液、總RNA提取試劑盒(上海華美生物工程公司)，TakaRa試劑盒(大連寶生物公司)，DNAMARKERDL-2000(大連博瑞得生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Primer引物合成試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司) 3.主要實(shí)驗(yàn)器材：Date

8、x氣體濃度監(jiān)測(cè)儀(CapnomacUltima芬蘭)，850型日立熒光分光光度計(jì)(日本)，1601島津紫外分光光度計(jì)(日本)，DF15D高速冷凍離心機(jī)(日本日立)，JEM-1200EX透射電鏡(美國(guó))，LKB-V型超薄切片機(jī)，KODAKID型凝膠成象分析系統(tǒng)(美國(guó))，PTR-100PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)) 二、實(shí)驗(yàn)方法1.ISO預(yù)處理：將鼠置于100cm×100cm×100cm的實(shí)驗(yàn)艙里，艙內(nèi)放入ISO，使ISO濃度維持在1.2％～

9、1.5％。 2.腦I/R模型：10％水合氯醛0.35gkg-1腹腔注射麻醉，頸正中切口，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉5min后再開放，24h后迅速取前腦。 3.實(shí)驗(yàn)分組：SHAM組：假手術(shù)組，只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈而未予夾閉。 IR組：用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5min后再開放24h。 ISO組：ISO預(yù)處理組，I/R前60minISO預(yù)處理30min，后在空氣中30min。 5-HD+IS

10、O組：5-HD(mitoKATP特異性阻滯藥)10mgkg-1腹腔內(nèi)注射，30min后同ISO組。 5-HD組：L/R前30min5-HD10mgkg-1腹腔內(nèi)注射。 AG+ISO組：AG(誘導(dǎo)型NO合酶抑制劑)200mgkg-1腹腔內(nèi)注射，30min后同ISO組。 AG組：L/R前30minAG200mgkg-1腹腔內(nèi)注射。 4.觀察指標(biāo)和測(cè)定方法1)線粒體懸浮液制備：低溫差異法分離線粒體，用分離介質(zhì)制

11、成懸浮液。 2)線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察(電鏡)3)線粒體Ca2+濃度的測(cè)定：根據(jù)Mccormack方法改進(jìn)。以Fura-2/AM為Ca2+熒光指示劑，用日本850型日立熒光分光光度計(jì)測(cè)定線粒體Ca2+濃度。發(fā)射波長(zhǎng)510nm，以430nm激發(fā)光譜掃描。 4)MPTP的測(cè)定：利用MPTP增大時(shí)線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導(dǎo)致吸光度明顯減少的原理。反應(yīng)條件為25℃、pH=7.4、線粒體蛋白濃度為0.5mgml-1。反應(yīng)體系加入150μ

12、molL-1Ca2+為激發(fā)劑，在540nm波長(zhǎng)處每分鐘記錄吸光度的變化(△S值)。 5)腦組織凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)變化(RT-PCR法) 結(jié)論：1.異氟烷預(yù)處理能夠減輕沙士鼠腦I/R引起的線粒體Ca2+超載。 2.異氟烷預(yù)處理對(duì)鼠腦I/R的保護(hù)作用是由抑制MPTP的開放介導(dǎo)的。 3.異氟烷預(yù)處理能誘導(dǎo)鼠腦組織中抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)及促凋亡基因Bax表達(dá)下調(diào)。 4.異