α-synuclein和tau相互作用參與錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制及染料木素的保護(hù)作用.pdf

1、背景：
　　錳是機(jī)體必需的一種微量元素,但攝入過量的錳則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。錳的毒性作用主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤其是基底核。慢性錳中毒主要表現(xiàn)為錐體外系功能障礙,與帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的臨床表現(xiàn)類似。
　　α-共核蛋白(α-synuclein,α-syn)是由140個(gè)氨基酸組成的可溶性非折疊蛋白,它是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)特征性病理結(jié)構(gòu)——路易氏小體

2、(Lewy’s body)的主要組成部分。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明高表達(dá)α-syn可促進(jìn)神經(jīng)元的損傷,誘導(dǎo)PD相關(guān)毒性癥狀的發(fā)生。因此越來越多的實(shí)驗(yàn)試圖揭示α-syn的生理功能及其在神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)制。但是關(guān)于α-syn的生理功能目前還不十分清楚,有研究表明α-syn參與調(diào)節(jié)突觸傳遞和神經(jīng)元的可塑性。另有研究提示它可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。近年來,許多研究證實(shí)α-syn在Lewy小體病和帕金森病的發(fā)生
　　機(jī)制中起到了

3、關(guān)鍵的作用,但是其在錳神經(jīng)毒性作用中的機(jī)制尚不清楚。
　　tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白,在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持微管功能等方面具有重要作用。生理和病理?xiàng)l件下,tau蛋白的許多蘇氨酸和絲氨酸殘基可以被多種激酶磷酸化。tau蛋白病理?xiàng)l件下的過度磷酸化將影響其正常功能,使其促微管聚合功能喪失,神經(jīng)元微管解體,tau蛋白聚集成雙螺旋絲(paired helical filaments,PHF)以及形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrill

4、ary tangle,NFT)結(jié)構(gòu),并轉(zhuǎn)變成為毒性分子,最終引起神經(jīng)元變性損傷。
　　作為存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì),α-syn與tau蛋白之間存在著相互作用。研究表明α-syn與tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)除了細(xì)胞核外大部分是共定位的,在靠近細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)邊緣,兩者的相互作用最強(qiáng)烈。新近研究表明tau蛋白突變可抑制α-syn與tau蛋白的相互作用;α-syn突變也可抑制α-syn與tau蛋白的相互作用。此外,截去羧基端的tau蛋白與α-

5、syn之間的相互作用也被抑制。
　　染料木素(genistein,Gen)又稱三羥異黃酮,主要是從大豆等豆科植物中提取出來的活性成分,為異黃酮類物質(zhì)中活性功能最高的一種。Gen對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有顯著的保護(hù)作用,其作用機(jī)制是多方面的。包括抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度、與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用、增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)功能、抑制凋亡等途徑,從而提高神經(jīng)細(xì)胞的存活能力。
　　目的：
　　在動(dòng)物和細(xì)胞水平探討錳對(duì)α-syn與tau蛋白

6、相互作用的影響,以及這種影響在錳神經(jīng)毒性中的作用。并進(jìn)一步探討染料木素對(duì)錳神經(jīng)毒性可能的抑制效應(yīng),以及這種抑制效應(yīng)與α-syn-tau的相關(guān)性。為進(jìn)一步闡明錳神經(jīng)毒性的分子機(jī)制以及尋找有效的防護(hù)措施提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用灌胃的方法建立慢性錳暴露的動(dòng)物模型,采用免疫熒光染色、Western blot和免疫共沉淀檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元的損傷以及α-syn與tau蛋白相互作用的變化。
　　2.利用高分

7、化型PC12細(xì)胞建立錳毒性的細(xì)胞模型,MTT、LDH和TUNEL檢測(cè)細(xì)胞毒性;siRNA轉(zhuǎn)染、Western blot、免疫熒光染色和免疫共沉淀檢測(cè)α-syn與tau蛋白相互作用的變化。
　　3.MTT、TUNEL和氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)染料木素對(duì)錳毒性的保護(hù)作用。同時(shí),利用Western blot、免疫熒光染色檢測(cè)染料木素對(duì)錳誘導(dǎo)的α-syn蛋白表達(dá)、tau磷酸化以及兩者共定位的影響。
　　結(jié)果：
　　1.錳對(duì)大鼠黑質(zhì)多

8、巴胺能神經(jīng)元損傷和α-syn與tau蛋白相互作用的影響
　　通過灌胃方法建立慢性錳暴露的動(dòng)物模型,免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示大鼠黑質(zhì)TH染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少,同時(shí)黑質(zhì)TH表達(dá)水平顯著降低,提示錳誘導(dǎo)了多巴胺能神經(jīng)元損傷;Western blot結(jié)果顯示大鼠黑質(zhì)α-syn和tau表達(dá)水平均升高;免疫熒光染色和免疫共沉淀結(jié)果顯示大鼠黑質(zhì)α-syn和tau蛋白共定位增強(qiáng),同時(shí)這兩種蛋白在黑質(zhì)的相互作用增強(qiáng)。

9、　　2.錳對(duì)PC12細(xì)胞的損傷以及對(duì)α-syn與tau蛋白相互作用的影響
　　MTT結(jié)果顯示,隨著染錳濃度的增加和染錳時(shí)間的延長,PC12細(xì)胞活力顯著下降;TUNEL結(jié)果顯示,隨著錳濃度的增加,PC12細(xì)胞凋亡水平逐漸增加;Western blot結(jié)果顯示錳可使PC12細(xì)胞α-syn與tau磷酸化水平增加;免疫熒光染色和免疫共沉淀結(jié)果顯示錳可使α-syn與tau蛋白在PC12細(xì)胞內(nèi)共定位增強(qiáng),同時(shí)α-syn和tau蛋白相互作用增強(qiáng)

10、。
　　3.siRNAα-syn和LiCl對(duì)錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞α-syn與tau蛋白相互作用的影響
　　MTT結(jié)果顯示,干涉α-syn的表達(dá)或者加入LiCl可以明顯改善錳對(duì)PC12細(xì)胞的活力抑制;Western blot結(jié)果顯示,干涉α-syn的表達(dá)可以使錳誘導(dǎo)的高p-tau396水平降低;免疫熒光染色結(jié)果顯示,siRNAα-syn和LiCl均可抑制錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞α-syn與tau蛋白的共定位;免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)一步顯

11、示LiCl可抑制錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞α-syn與tau蛋白的相互作用。
　　4.染料木素對(duì)錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用
　　MTT結(jié)果顯示,染料木素可以明顯抑制錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力下降;TUNEL結(jié)果顯示,染料木素可以抑制細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)結(jié)果提示,染料木素可以抑制錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的增高。此外,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,染料木素可抑制錳誘導(dǎo)的α-syn蛋白表達(dá)水平的增高以及ta

12、u蛋白的磷酸化。免疫熒光染色結(jié)果表明染料木素可抑制錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)α-syn與tau蛋白共定位的增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明,錳可以引起多巴胺能神經(jīng)元的損傷,誘導(dǎo)α-syn與p-Tau396蛋白表達(dá)水平增加;使α-syn與p-tau396蛋白相互作用增強(qiáng),并且其共定位增強(qiáng)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)表明,分別降低α-syn或p-Tau396蛋白的表達(dá)水平,可在抑制錳毒性的同時(shí)一定程度上抑制錳誘導(dǎo)的兩種蛋白

13、相互作用的增強(qiáng)。表明α-syn和p-Tau396蛋白的相互作用可能在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定的作用。
　　3.染料木素可抑制錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性,其機(jī)制可能與其抑制錳誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,α-syn蛋白表達(dá)水平增高,tau蛋白的磷酸化以及α-syn與tau的相互作用有關(guān)。
　　綜上所述,我們的研究初步闡明錳誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷作用中存在α-syn和p-Tau396蛋白的相互作用,這種作用可能參與了錳誘導(dǎo)的損傷過