染料木素對Aβ誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、染料木素（Genistein，Gen）是大豆異黃酮苷元的主要成份之一，廣泛存在于豆科植物中。染料木素因其結(jié)構(gòu)與雌激素類似，故被稱為植物雌激素，具有弱雌激素樣作用和抗雌激素活性。對腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松及更年期癥狀等均具有防治作用，并且可以提高機體的免疫功能，其廣泛應(yīng)用于制藥、營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域。有研究表明，染料木素對神經(jīng)細胞具有明顯的保護作用，對AD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病有一定的防治作用。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)，染料木素可作用于海馬神經(jīng)細胞

2、，通過蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)信號通路上調(diào)α-分泌酶活性的和下調(diào)β-分泌酶活性，降低不溶性β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)片段的形成與沉積，從而抑制Aβ對海馬神經(jīng)細胞的毒性，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本論文將繼續(xù)在細胞水平就染料木素的細胞保護作用及其分子機制作進一步的研究。具體內(nèi)容如下：
　　1.以Aβ25-35毒素誘導(dǎo)PC12細胞損傷，構(gòu)建細胞損傷模型，用不同濃度的Gen預(yù)處理2h后，再加入Aβ2

3、5-35繼續(xù)孵育24h，形態(tài)學(xué)方法和MTT法檢測PC12細胞形態(tài)變化和存活率；Hoechst33342/PI雙染檢測細胞凋亡并計算凋亡率；分光光度法檢測Caspase-3活性；鈣離子熒光探針Fluo-3/AM和熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度，從而探討Gen對PC12的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35對PC12細胞的毒性作用有明顯的劑量依賴性，隨著Aβ濃度的增加，其損傷作用增強，20μmol/L Aβ25-35作用于PC12細胞2

4、4h后可構(gòu)建細胞損傷模型；25μmol/L的Gen能減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞形態(tài)損傷；提高細胞存活力；減少細胞凋亡率；降低Caspase-3活性及抑制細胞內(nèi)Ca2+超載，表明Gen對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷具有保護作用。
　　2.將PKC抑制劑（Myristoylated Protein Kinase C Peptide Inhibitor，Myr)終濃度為50μmol/L預(yù)給藥1h，阻斷PKC信號通路，加

5、入Gen預(yù)孵育2h，再加入Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測 PKC活性的改變；同時進行形態(tài)觀察，MTT細胞活力檢測，Hoechst33342/PI細胞凋亡檢測，Caspase-3活性及細胞內(nèi)Ca2+濃度測定，研究PKC抑制劑Myr對Gen的細胞保護作用的影響，從而探討Gen調(diào)節(jié)PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。通過Real time PCR檢測Gen及Myr對抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達的影響，從而進一步探討染料木素對Aβ誘導(dǎo)

6、的PC12細胞損傷的保護作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gen能有效提高Aβ誘導(dǎo)的PC12細胞內(nèi)的PKC活性，這種磷酸化水平能被Myr所抑制；Myr抑制劑阻斷了染料木素對PC12細胞損傷的保護作用，使得細胞損傷程度增加，細胞活力降低，凋亡率、Caspase-3活性及細胞內(nèi)Ca2+濃度均升高。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Gen能上調(diào)Bcl-2mRNA表達，下調(diào)Bax mRNA表達，增加Bcl-2/Bax的比值，從而抑制Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡，而Myr抑制劑可以阻斷Gen