白藜蘆醇在β-淀粉樣蛋白誘導PC12細胞損傷中的保護作用及其機制的實驗研究.pdf

1、阿爾茨海默病是老年人中最常見的神經(jīng)退行性病。該病的主要病理學特征為腦內(nèi)神經(jīng)元斑塊沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，并引發(fā)神經(jīng)突觸和腦內(nèi)神經(jīng)元缺失。隨著世界人口的老齡化加劇，阿爾茨海默病的發(fā)病率日趨上升，已成為當前老年醫(yī)學面臨的最為嚴峻的問題之一，然而，目前尚不清楚神經(jīng)元退變損傷的分子機制，臨床上對阿爾茨海默病亦缺乏有效地治療手段。
　　 研究表明，β-淀粉樣蛋白（β-amyloidprotein，Aβ）的沉積是阿爾茨海默病的始發(fā)因素和關鍵環(huán)

2、節(jié)，是腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失的直接因素。Aβ可導致神經(jīng)元損傷，誘導細胞凋亡。因此，降低Aβ細胞毒性、抑制Aβ異常沉積已成為研究阿爾茨海默病發(fā)病機制，尋找治療方法的關鍵點。近年來有關中藥治療阿爾茨海默病的研究越來越多。白藜蘆醇是一類廣泛存在于葡萄、虎杖等植物中的多酚類化合物。具有抗氧化、抗炎癥、抗癌及抗衰老等作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對H2O2、MPP、Aβ及6-羥多巴胺誘導的神經(jīng)元損傷中都有一定的保護作用，并能夠有效延緩阿爾

3、茨海默病和亨汀頓舞蹈癥的認知、學習、記憶與行為功能障礙。白藜蘆醇對神經(jīng)元的保護作用已經(jīng)引起神經(jīng)科學家的廣泛關注。
　　 白藜蘆醇可以通過調(diào)控多個基因和信號通路而發(fā)揮神經(jīng)保護的作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能誘導沉默信號調(diào)控因子(Silencesignalregulatingfator1，SIRT1)的高表達，從而引起一系列信號通路的改變。SIRT1是沉默信號調(diào)控因子sir-2的同源物，它參與基因轉(zhuǎn)錄、延長復制周期、能量代謝及延緩細胞衰

4、老等生物過程。在阿爾茨海默病模型大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)SIRT1高表達能增強淀粉樣前體蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)的非淀粉樣蛋白分解途徑，減少Aβ的沉積。
　　 在SIRT1對阿爾茨海默病的保護機制研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1轉(zhuǎn)基因小鼠來源的原代神經(jīng)元中，β-淀粉樣蛋白含量減少，同時ROCK1的表達降低。以往的研究也發(fā)現(xiàn)，ROCK1能夠調(diào)節(jié)α-蛋白激酶活性，與淀粉樣前體蛋白的代謝有關。這說明SIRT

5、1增強α-分泌酶介導的APP非淀粉樣蛋白途徑可能部分通過ROCK1通路，然而，SIRT1與ROCK1之間的調(diào)控關系以及二者在白藜蘆醇對抗Aβ誘導神經(jīng)元損傷中的作用并不清楚。
　　 基于以上的研究，為探討白藜蘆醇對Aβ25-35毀損神經(jīng)元的保護作用，并探討SIRT1和ROCK1在該過程中的作用機制，我們設計了本項實驗:(1)選用PC12細胞作為神經(jīng)元培養(yǎng)模型，加入不同濃度的Aβ25-35，觀察Aβ25-35對PC12細胞的損傷情況

6、;(2)在Aβ25-35毀損PC12細胞的培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的白藜蘆醇，通過MTT和LDH檢測，觀察白藜蘆醇對Aβ25-35損傷PC12細胞的保護作用，并分析篩選出其最佳保護濃度;(3)通過Hoechst33342/PI雙染、流式細胞術及細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測分析白藜蘆醇對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡情況的影響;(4)為進一步探討探討白藜蘆醇發(fā)揮神經(jīng)保護作用的分子機制，我們應用RT-PCR和Westernblot技術檢測了SIR

7、T和ROCK1在mRNA水平和蛋白水平的表達變化;(5)應用尼克酰胺（SIRT1的抑制劑）和Y-27632(ROCK1的抑制劑)處理PC12細胞，進一步明確SIRT1及ROCK1在白藜蘆醇對抗Aβ25-35毀損PC12細胞中的作用及二者之間的調(diào)控關系。
　　 本實驗的研究結(jié)果顯示，
　　 (1)給予10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L的Aβ25-35毀損PC12細胞，可見細胞的突起從遠端開始崩解、碎裂。隨

8、著Aβ25-35濃度的升高，PC12細胞毀損逐漸加重。MTT結(jié)果顯示細胞活性與Aβ25-35濃度呈負相關。在Aβ25-35的三個濃度組中，20μmol/L濃度傷易于觀察與檢測，作為后續(xù)實驗中細胞損傷的選用濃度。在Aβ25-35毀損前2h，給予12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L四個濃度的白藜蘆醇預孵育PC12細胞，經(jīng)細胞生長觀察及MTT、LDH細胞活性分析，各濃度組均呈現(xiàn)明顯的保護作用（P＜0.0

9、1），其中50μmol/L白藜蘆醇保護組的保護作用強于其他濃度組(P＜0.01），選為研究白藜蘆醇保護作用的使用濃度。
　　 (2)Hoechst33342/PI雙染結(jié)果顯示，白藜蘆醇保護組的細胞凋亡率明顯低于Aβ25-35損傷組(P＜0.01);流式細胞術檢測結(jié)果顯示，白藜蘆醇能夠有效地同時抑制Aβ25-35誘導的早期凋亡和晚期凋亡(P＜0.01);細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測結(jié)果顯示，Aβ25-35損傷組細胞鈣離子熒光強度較空白對照

10、組明顯增強，鈣離子濃度顯著升高，給予白藜蘆醇保護以后，鈣離子熒光強度較Aβ25-35損傷組明顯減弱(P＜0.01)。
　　 (3)RT-PCR和Westernblot的結(jié)果均顯示，Aβ25-35抑制SIRT1的表達，同時增強ROCK1的表達（P＜0.01），給予白藜蘆醇后，可明顯增加PC12細胞SIRT1表達，降低ROCK1表達（P＜0.01）。為進一步明確SIRT1及ROCK1的作用及調(diào)控關系，本實驗應用了SIRT1的抑制劑尼

11、克酰胺和ROCK1的抑制劑Y-27632，結(jié)果顯示，尼克酰胺顯著地抑制SIRT1的表達并激活ROCK1的表達(P＜0.01);Y-27632明顯抑制ROCK1的表達（P＜0.01），而對SIRT1的表達幾乎沒有影響。以上數(shù)據(jù)說明，ROCK1是SIRT1下游的一個信號分子，并且受SIRT1的負調(diào)控。
　　 本項研究表明，白藜蘆醇通過激活SIRT1進而抑制其下游信號分子ROCK1，對抗β-淀粉樣蛋白誘導的PC12細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保