NRG1-ErbB4通過(guò)GABA能系統(tǒng)抑制杏仁外側(cè)核的LTP.pdf

1、精神分裂癥是一種嚴(yán)重危害人類健康的精神疾病,它影響著全世界約1％的人口。Neuregulin1(NRG1)與ErbB4作為精神分裂癥眾多易感基因中的一員,在近年來(lái)正在被越來(lái)越多的人重視并已成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 Neuregulin是一類隸屬于營(yíng)養(yǎng)因子家族的多肽因子,其由NRG基因編碼產(chǎn)物的選擇性剪切體所組成。在NRG的多種異構(gòu)體當(dāng)中(NRG 1-4),對(duì)NRG1的研究最為廣泛。NRG1通過(guò)ErbB受體酪氨酸激酶起作

2、用,ErbB受體同樣具有多種異構(gòu)體(ErbB1-4)。其中ErbB4在腦內(nèi)高表達(dá),并與NRG1結(jié)合后可激活其酪氨酸激酶的活性。NRG1-ErbB4信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用,并且以往的研究大都集中于此?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它參與了神經(jīng)細(xì)胞的分化、神經(jīng)元的遷移、神經(jīng)突起的外向性生長(zhǎng)和突觸的形成等多個(gè)神經(jīng)發(fā)育過(guò)程。盡管NRG1和ErbB4受體在成年的嚙齒類動(dòng)物和人的大腦中也高度表達(dá),但目前對(duì)于NRG1-ErbB4信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)功能的

3、認(rèn)識(shí)絕大部分儀限于早期發(fā)育階段,對(duì)于此信號(hào)通路在成年腦區(qū)中的作用以及對(duì)于其在精神分裂癥中的病理機(jī)制仍然不甚明了。
　　 精神分裂癥病人表現(xiàn)有情感異常,MRI的研究證明這些情感異常與杏仁核十分相關(guān)。近年的研究顯示NRG1突變小鼠表現(xiàn)出情景恐懼記憶以及社交障礙。眾所周知,恐懼記憶是反映大腦形成不良情感記憶的一種常用的模型。已有研究證明杏仁核在恐懼記憶模型中扮演著事十分關(guān)鍵的角色,而杏仁核的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)被認(rèn)為是形成恐懼記憶的一

4、個(gè)重要機(jī)制。與其它腦區(qū)不同,杏仁核神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏撵o息發(fā)放水平很低,這主要是由于該腦區(qū)具有很強(qiáng)的GABA能抑制活性,并且,GABA能抑制對(duì)杏仁核LTP也具有很強(qiáng)的控制作用。而目前對(duì)杏仁核這種強(qiáng)GABA能抑制的機(jī)制尚不清楚。在海馬,NRG1可通過(guò)激活ErbB4抑制LTP的誘導(dǎo),有研究表明ErbB4受體存在于GABA(γ-aminobutyricacid)能神經(jīng)元的突觸前末梢,NRG1可通過(guò)激活突觸前的ErbB4受體增強(qiáng)活動(dòng)依賴的GABA釋

5、放。因此有必要研究:杏仁核中NRG1-ErbB4信號(hào)通路是否通過(guò)調(diào)節(jié)GABA能系統(tǒng)來(lái)控制LTP的誘導(dǎo)水平。
　　 首先,我們記錄了EPSC與IPSC的輸入-輸出關(guān)系(I-o),并使用IPSC/EPSC比證明了杏仁核相較于其它腦區(qū)具有更高GABA能水平。我們同時(shí)比較了外側(cè)杏仁核,海馬(CA1)與皮層(頂葉皮層,第五層細(xì)胞)所記錄的IPSC的最大值。與海馬(506.41±65.45 pA,n=10)及皮層(682.44±79.98

6、pA,n=9)相比,在外側(cè)杏仁核的興奮性神經(jīng)元可以記錄到更大幅度的IPSC(871.40±57.07pA,n=10),其中儀外側(cè)杏仁核與海馬兩組間有顯著性差異(P<0.05,one wayANOVA)。隨后觀察了上述三個(gè)腦區(qū)的輸入-輸出關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)只有外側(cè)杏仁核的IPSC I-O曲線保持在EPSC I-O曲線的上方,而海馬和皮層IPSC I-O曲線均落在了EPSC I-O曲線的下方。而且,從IPSC/EPSC比可以看出外側(cè)杏仁核與海馬

7、(其在20,25,30,35,40V刺激強(qiáng)度下,P<0.05,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))和皮層(在10,15V的刺激強(qiáng)度下,P<0.05,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))均有顯著的差異。與以上結(jié)果相符,在外側(cè)杏仁核中無(wú)法誘導(dǎo)出LTP。當(dāng)給予丘腦傳入纖維一個(gè)強(qiáng)直刺激(HFS)后,所記錄到的fEPSP強(qiáng)度相對(duì)于刺激前的基線只有102.3±2.5％(n=8)。與此相反,HFS刺激則可在海馬CA1區(qū)誘導(dǎo)出LTP(158.5±11.2％,n=14)。使用獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)也

8、顯示出兩個(gè)區(qū)域所誘導(dǎo)的LTP水平有顯著性的差異(P=0.000)。這一結(jié)果提示外側(cè)杏仁核中較高的GABA能水平阻止了LTP的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步肯定GABA能系統(tǒng)對(duì)LTP的抑制作用,在灌流液中加入20μM荷包牡丹堿(Bicuculline methiodidie,BMI,GABAA受體阻斷劑)以觀察誘導(dǎo)LTP的情況。我們發(fā)現(xiàn)在20μM荷包牡丹堿存在情況下,在外側(cè)杏仁核可誘導(dǎo)出顯著的LTP,其幅度為119.2±1.6％(n=6),而對(duì)照腦片中

9、其幅度只有102.34±2.5％(n=8),且兩組間有顯著性差異(P<0.05)。這一結(jié)果表明GABA能系統(tǒng)抑制了外側(cè)杏仁核中LTP的產(chǎn)生。
　　 為了探討NRG1-ErbB4是否可以調(diào)節(jié)GABA能抑制系統(tǒng),我們?cè)诠嗔?mM犬尿喹啉酸(廣譜的谷氨酸受體抑制劑)的條件下,使用雙極電極刺激丘腦傳入,記錄了外側(cè)杏仁核興奮性神經(jīng)元中誘發(fā)的抑制性突觸后電流(eIPSC)。灌流NRG1(2nM,n=9)對(duì)IPSC的幅度無(wú)顯著影響。NRG1灌

10、流10分鐘后標(biāo)準(zhǔn)化的IPSC幅度為0.90±0.05(P>0.05)。與此相反,灌流ecto-ErbB4(克隆蛋白,包含ErbB4的胞外段,可中和NRG1蛋白而起到抑制NRG1-ErbB4信號(hào)活性的作用)或AG1478(一種脂溶性的ErbB受體抑制劑,其可以阻止受體的自磷酸化并阻斷其信號(hào)傳遞)均可顯著抑制IPSC的幅度,ecto.ErbB4或AG1478處理后標(biāo)準(zhǔn)化IPSC幅度分別為0.65±0.05(2μg/ml,n=8,P<0.01

11、)和O.70±0.04(5μM,n=10,P<0.01)。以上結(jié)果表明NRG1對(duì)eIPSC無(wú)明顯影響,而NRG1-ErbB4通路的阻斷劑則可以抑制eIPSC,提示生理?xiàng)l件下外側(cè)杏仁核NRG1-ErbB4通路對(duì)GABA能系統(tǒng)的調(diào)控作用處于飽和狀態(tài)。
　　 為了探討NRG1-ErbB4是否可以調(diào)節(jié)外側(cè)杏仁核中的LTP,我們進(jìn)行了以下三組實(shí)驗(yàn)。空白對(duì)照組:強(qiáng)直刺激后fEPSP的幅度為刺激前基線的99.874±3.15％(n=8)；NR

12、G1處理組:105.49±2.47％(n=6)；ecto-ErbB4(2μg/ml,n=7)處理組:117.97±3.72％。統(tǒng)計(jì)處理顯示ecto-ErbB4處理組與其他兩組之間都有顯著性的差異(F=8.092,P=O.003,P<0.05與對(duì)照相比)。這一結(jié)果表明NRG1-ErbB4信號(hào)通路在外側(cè)杏仁核區(qū)控制著LTP的誘導(dǎo),并且處于一種相對(duì)飽和的狀態(tài)而只能被負(fù)調(diào)控。
　　 同樣,2μg/ml ecto-ErbB4預(yù)處理后,在皮

13、層傳入施加強(qiáng)直刺激可誘導(dǎo)出LTP(123.05±4.82％,n=8),與對(duì)照腦片(107.59±2.90％,n=6)相比有顯著性的差異(P<0.05)。這一結(jié)果顯示與丘腦傳入相同,抑制NRG1-ErbB4信號(hào)通路可在外側(cè)杏仁核的皮層傳入也誘導(dǎo)出LTP,這說(shuō)明NRG-ErbB4信號(hào)對(duì)杏仁核LTP的調(diào)控?zé)o通路選擇性。
　　 由于阻斷GABAA受體或NRG1/ErbB4通路均可增強(qiáng)外側(cè)杏仁核區(qū)中LTP的產(chǎn)生,所以我們認(rèn)為,NRG1/E

14、rbB4通路的阻斷劑可能是通過(guò)降低GABA能抑制從而增強(qiáng)了LTP。為了驗(yàn)證這一假說(shuō),我們比較了單獨(dú)灌流20 μM BMI與同時(shí)灌流20 μM BMI和2μg/ml ecto-ErbB4兩種不同情況下所誘導(dǎo)LTP的幅度,以此觀察兩者之間是一種協(xié)同作用還是一種相互疊加的作用。我們發(fā)現(xiàn)這兩種方式處理后都可以誘導(dǎo)出LTP,并且同時(shí)灌流BMI和ecto-ErbB4組與單獨(dú)灌流BMI組所誘導(dǎo)的LTP幾乎相同。單獨(dú)灌流BMI組所誘導(dǎo)的LTP幅度為11

15、9.234±1.61％(n=6),同時(shí)灌流BMI和ecto-ErbB4組為120.76±5.68％(n=8),兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 我們進(jìn)一步觀察了ecto-ErbB4對(duì)基礎(chǔ)興奮性突觸傳遞的影響。我們分別在加藥前與加藥20分鐘后記錄了fEPSP的輸入輸出曲線(I-O),發(fā)現(xiàn)ecto-ErbB4對(duì)I-O曲線沒有影響。并且,加藥前后的PPF(雙脈沖易化,反映突觸前的機(jī)制)同樣也無(wú)顯著性差異。
　　 隨后,我們使用了一

16、種ErbB4受體敲除鼠(ErbB4-/-HER4heart),以此進(jìn)一步證明NRG1-ErbB4通路對(duì)外側(cè)杏仁核的GABA能系統(tǒng)及LTP誘導(dǎo)的調(diào)控作用。首先我們比較了敲除鼠與野生型鼠中所記錄的最大IPSC的差異。與野生型鼠相比(809.10±83.69pA,n=12),雖然ErbB4-/-HER4heart鼠顯示了更小的IPSC幅度(619.09±72.65pA,n=18),但兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(P>0.05,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。與野

17、生型相反,敲除鼠IPSC的I-O曲線落到了EPSC I-O曲線的下方。更重要的是,敲除鼠的IPSC/EPSC比值明顯小于野生型(在15,20,25,30,35,40,50V刺激強(qiáng)度下,P<0.05,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。
　　 接下來(lái),我們進(jìn)一步比較了ErbB4敲除鼠與野生型之間LTP的差別。我們同樣選擇了丘腦傳入給以強(qiáng)直刺激,刺激后在野生型鼠中記錄到的fEPSP的幅度為基線的105.93±5.09％(n=7)。于此相反,在ErbB

18、4-/-HER4heart敲除小鼠中可以誘導(dǎo)出幅度為121.94±3.42％的LTP(n=6),明顯大于野生型(P<0.05)。此外,我們又在敲除鼠的腦片中加入BMI,以此觀察其是否可進(jìn)一步增加LTP,結(jié)果顯示LTP的幅度為119.22±4.76％(n=5),與未處理敲除鼠相比無(wú)顯著性差異。
　　 綜上所述,我們的研究結(jié)果提示,外側(cè)杏仁核相對(duì)飽和的NRG1/ErbB4信號(hào)通路參與維持高水平的GABA能系統(tǒng),進(jìn)而阻止了LTP的產(chǎn)生